Découverte de Quinazolin-2-ones 4,4-disubstituées comme canal de calcium de type T Antagonistes

Les canaux calciques voltage-dépendants représentent des cibles médicamenteuses potentielles en raison de leur rôle critique dans de nombreux processus physiologiques.1 Sur la base du clonage de la sous-unité principale formant les pores, ils peuvent être divisés en trois familles principales: Cav1.x (type L), Cav2.x (N-, P / Q-, type R) et Cav3.x (type T) .2 Un certain nombre de médicaments cliniquement utiles modulent les canaux de type L, 1 et le développement du ziconotide a stimulé plus d’intérêt dans le canal calcique de type N. Le canal calcique de type T suscite également beaucoup d’intérêt pour le traitement des troubles du système nerveux central (SNC). Parmi les trois canaux calciques de type T, les sous-types Cav3.1 et Cav3.3 sont principalement exprimés dans le cerveau, alors que Cav3.2 a une expression centrale et périphérique plus large.4 Les premières investigations des antagonistes des canaux calciques périphériques de type T ont porté sur: Leur rôle potentiel dans la régulation de la pression artérielle a permis d’identifier le mibéfradil, qui a été brièvement commercialisé comme antihypertenseur5. Bien que le mibéfradil ait une certaine sélectivité in vitro pour les canaux de type T sur le type L, l’abaissement de la tension artérielle Chez les souris knock-out conditionnelles de type canal calcique, les résultats avec le mibéfradil doivent être interprétés avec prudence6. Dans le SNC, des canaux calciques de type T sont impliqués dans plusieurs affections, notamment le sommeil, l’épilepsie 7,8 et la douleur. .10 Les canaux de type T sont fortement exprimés dans le thalamus et le cortex et jouent un rôle important dans la signalisation thalamocorticale.11 Par conséquent, nous avons cherché à identifier les composés ayant une meilleure sélectivité pour les canaux de type T que Le mibéfradil et le potentiel de pénétration cérébrale permettent d’évaluer comment la modulation de ces canaux pourrait être utilisée pour traiter les troubles du SNC. Des rapports récents de ces laboratoires ont révélé des antagonistes des canaux calciques sélectifs à base de pipéridine de type T 1 et 2 (Fig. Figure1) 1) qui montrent une efficacité in vivo dans les modèles d’épilepsie et de tremblement tout en ayant des effets minimes sur le système cardiovasculaire.12,13 Dans le cadre du criblage FLIPR à haut débit qui a découvert la série de pipéridine dont on a dérivé 1 et 2, une autre classe de composés illustrés par la quinazolinone 3 (figure ​ (figure1) 1) a été identifié. Initialement, les quinazolinones telles que 3 ont été préparées chez Merck en tant qu’inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) du VIH, et on en sait beaucoup sur cet hétérocycle, ce qui en fait un point de départ intéressant14. résultats ont donné une structure claire et les tendances de la relation d’activité (SAR) qui ont été utilisés pour donner la priorité à la synthèse analogique initiale.Les composés ont été préparés par les méthodes établies pour les INNTI, 15 comme indiqué dans le schéma 1. Amino benzophénones 4 ont été traités avec du carbonyl diimidazole suivi de l’amine primaire désirée pour donner un mélange équilibré de 5 et 6. Lorsque R = Et ou cyclopropyle, un simple chauffage de ce mélange dans du toluène et une élimination d’eau avec un piège Stark de Dean ont permis produit déshydraté 7 sous la forme d’un solide cristallin qui a été isolé directement du mélange réactionnel. Le composé 7 a pu être traité avec un réactif de Grignard pour donner les composés 8 désirés, qui ont été résolus en leurs énantiomères respectifs par Chromatographie chirale. La détermination de la stéréochimie absolue a été faite par dispersion anormale aux rayons X d’analogues bromés (voir l’information justificative) 200 pour 10 et 12 avec les autres assignés par analogie. Lorsque R = trifluoroéthyle, il n’a pas été possible d’isoler le produit déshydraté 7. Par conséquent, le mode opératoire de Magnus et al.16 a été employé, le traitement du mélange de 5 et 6 avec du chlorure de thionyle et de la triéthylamine dans THF générant l’intermédiaire 7 in situ, suivi de l’addition d’un large excès du réactif de Grignard pour donner les quinazolinones 4,4-disubstituées 8 où R = trifluoroéthyle.Schème 1Table 1In Vitro et données in vivo pour les antagonistes du canal calcique de type T La puissance sur le canal calcique de type T était déterminé par deux tests FLIPR conçus pour mesurer la puissance sur l’état inactivé du canal (test dépolarisé) et l’état de repos du canal (dosage hyperpolarisé) comme décrit précédemment.19 Initial SAR, à la fois minière de la pléthore d’analogues de quinazolinone déjà préparés pour le programme NNRTI et la synthèse ciblée ont montré que le plomb était résistant aux changements drastiques. Le remplacement du groupement méthyle en position 3 du plomb par un groupement éthyle conduit à une légère amélioration de la puissance, et la résolution des énantiomères fournit les composés 8a et 8b qui montrent que la majorité de l’activité réside dans un énantiomère (Tableau 1). .Il a été connu de la littérature NNRTI14 qu’une N-dealkyation rapide du groupe alkyle en position 3 de la quinazolinone limitait la biodisponibilité orale de ces composés; par conséquent, le composé 9 (TTA-Q2) 300 a été préparé avec un groupe cyclopropyle en position 3 pour limiter cette voie. Cette modification a permis d’obtenir un composé ayant une biodisponibilité significative (44%) 20 tout en améliorant la puissance sur le canal de type T, en particulier dans le test d’état dépolarisé. En comparant les deux dosages FLIPR, il y avait plus de 10 fois plus de puissance en fonction du potentiel membranaire au repos de la lignée cellulaire test, ce qui la rend plus dépendante de l’état que les autres inhibiteurs que nous avons étudiés jusqu’ici (1 et 2) Figure ​ (Figure1) .1). Cependant, il est très fréquent que les bloqueurs de canaux ioniques présentent une inhibition dépendante de l’état. Des exemples de médicaments dépendants de l’état incluent la nifédipine (canaux Ca2 + de type L) et la phénytoïne (canaux Na +) .22 On ignore si les bloqueurs dépendants de l’état auront les mêmes effets in vivo que les pipéridines 1 et 2, ce qui en fait un outil utile. Une propriété additionnelle de 9 importante pour l’inhibition des canaux centraux de type T in vivo est qu’elle n’est pas un substrat pour le transporteur de la P-glycoprotéine (P-gp) comme démontré dans un rapport BA / AB de 1,6 in. Une lignée cellulaire exprimant la P-gp.23 Deux heures après l’administration orale chez le rat, il a été déterminé que 9 avait un rapport cerveau: plasma de 1,3: 1, démontrant sa valeur en tant qu’outil in vivo pour comparer cette série aux précédentes. pipéridines. Nous avons commencé avec un modèle génétique d’absence d’épilepsie chez le rat à l’aide de rats Wistar albinos Glaxo élevés à Rijswijk, aux Pays-Bas (WAG / Rij). Ces rats présentent des profils EEG corticaux et des comportements physiques caractéristiques d’une maladie épileptique, y compris des crises fréquentes.24 Les canaux calciques de type T étant impliqués dans la régulation des rythmes thalamocorticaux sous-jacents à ces crises, la mesure de l’EEG chez ces animaux sert de pharmacodynamique. lecture de la pénétration cérébrale et de l’activité du canal de type T. De manière similaire aux pipéridines 1 et 2, le composé 9 présentait une inhibition robuste du temps d’épilepsie, avec une réduction de 61% au cours des 4 premières heures après l’administration orale à 3 mg / kg. L’effet similaire du composé 9 dans ce modèle, malgré un décalage de 10 fois dans la puissance des tests FLIPR, suggère qu’un inhibiteur dépendant de l’état a des effets similaires à un inhibiteur indépendant de l’état dans ce modèle animal. Tableau 2 Paramètres pharmacocinétiques de 10Further le profilage de 9 dans les tests métaboliques a montré qu’il s’agissait d’un inhibiteur dépendant du temps (CYP3A4,25) avec seulement 15% de l’activité totale du CYP3A4 restant après une préincubation de 30 min avec 9. Parce que les cyclopropylamines sont notoires pour cet effet, 26 nous exploré d’autres analogues à 3 positions. On a trouvé qu’un petit groupe alkyle était nécessaire pour la puissance, et un groupe trifluoroéthyle s’est avéré à la fois puissant et métaboliquement robuste. L’addition d’un fluor au 4-phényle de la quinazolinone a produit 10, ce qui était un TDI du CYP3A4 plus faible par rapport à 9. Un profil pharmacocinétique complet de 10 a montré qu’il avait une demi-vie de 3 h et de 4 h entre les espèces et biodisponibilité chez le rat et le rhésus (Tableau 2). Un profilage supplémentaire de 10 a révélé une activation modérée (63% par rapport à la rifampicine témoin) du récepteur du pregnane X (PXR) dans un test SEAP in vitro.27 L’activation du PXR pourrait l’induction du CYP3A4 et présente donc un risque potentiel d’interactions médicamenteuses; par conséquent, la minimisation de cette activité est souhaitable.28 La modélisation moléculaire a suggéré27 que l’introduction de groupes polaires sur le cycle 4-aryle peut aider à réduire la propension à se lier au récepteur PXR. Alors que cette approche conduisait généralement à des réductions significatives de la puissance, un nitrile en position 4 était mieux toléré. Une exploration plus poussée du substituant 4-alkyle a démontré une augmentation significative de la puissance avec l’introduction d’un cyclopropane en position 4 tel que le composé 11 (tableau 1); cependant, ce changement s’est accompagné d’une augmentation de l’activation du PXR à 99% de la rifampicine. La combinaison du cyclopropane avec la modification 4-cyano donne le composé 12 (TTA-Q6), qui a une bonne puissance et une activation du PXR réduite par rapport à 11. Une autre évaluation avec des hépatocytes humains montre une légère amélioration avec le composé 12 % d’ARNm du CYP3A4 augmente par rapport à la rifampicine à 1 μ M). Le composé 12 présentait également un bon profil pharmacocinétique à travers les espèces comme indiqué dans le tableau 3 et n’était pas un substrat PGP (Tableau 1), avec un rapport cerveau / plasma chez les rats de 1,1 mesuré 2 h après administration orale à 10 mpk.Confirmation du FLIPR la puissance a été réalisée par un enregistrement de patch clamp à cellules entières à deux potentiels de maintien, − 100 et − 80 mV. Le composé 12 a montré des puissances de 1 μ M et 221 nM, respectivement (Figure 22). Figure 2 Inhibition du sous-type Cav3.3 du canal calcique de type T par 12 comme déterminé par une pince de tension standard.Les points de données reflètent les moyennes ± SE de trois déterminations. Les valeurs IC50 de 221 nM et 1 μ M ont été déterminées à − 80 et − 100 … Les composés de cette série ont également été évalués dans un test de liaison et se sont avérés être des modulateurs allostériques positifs de la liaison Le composé 12 a été le modulateur le plus puissant identifié dans la série avec un point d’inflexion de 0,8 nM.29 Pour examiner la sélectivité des canaux ioniques, le composé 12 a été dosé contre des canaux cardiaques sodiques et potassiques importants. Le composé 12 n’est pas un puissant inhibiteur des canaux Nav1.5, IKr et IKs avec IC50 > 10 μ M sur ces canaux. Malgré sa similitude avec le NNRTI 3 du VIH, le composé 12 était inactif (> 10 μ M) dans un test de transcription inverse du VIH.14 Les paramètres pharmacocinétiques de 12Toth 10 et 12 montraient de bons profils globaux et ont été examinés dans plusieurs essais in vivo sensibles aux antagonistes des canaux calciques de type T. Les deux composés ont montré une inhibition robuste des crises dans le modèle d’épilepsie WAG / Rij après administration orale à raison de 3 mg / kg (Tableau 1). Un tremblement essentiel est également associé à un dysfonctionnement thalamocortical30 et un modèle de tremor induit par l’harmaline chez le rat a été établi pour évaluer les antagonistes des canaux calciques de type T. 31 Les pipéridines 1 et 2 se sont révélées efficaces dans ce modèle, 12,13 et 10 a été examiné de la même manière. Les rats ont reçu le composé 10 et 60 minutes plus tard on leur a administré 10 mg / kg d’harmaline, ce qui induit un tremblement dans la plage de 12 Hz qui est supprimée en fonction de la dose de 10, comme illustré sur la figure ​ Réponse 3Dose de 10 dans le modèle de tremblement essentiel induit par l’harmaline après un dosage de po à 3 et 10 mpk dans 90% de PEG400 (n = 8 & par 1012). * p < 0,001 test F global. Un autre processus important qui a un composant thalamocortical significatif est la régulation de l'excitation. Pour évaluer les effets des antagonistes de type T sur le sommeil et le sillage, des enregistrements télémétriques d'électrocorticogramme (ECoG) et d'électromyogramme (EMG) ont été mesurés chez des rats. Dans une conception de croisement de 7 jours, le véhicule ou le composé 12 a été dosé par voie orale tous les jours, 30 minutes avant la phase inactive (lumières allumées pour les rats). Les signaux ECoG et EMG ont été collectés et notés pour la durée de réveil ou chaque phase de sommeil (sommeil léger, sommeil delta, REM). Remarquablement, une dose de 10 mg / kg de 12 à des rats juste avant leur période de sommeil a produit suppression du sillage actif pendant 0,5 et 2 h après le dosage, un effet constant qui a commencé avant que les lumières ne s'allument (Figure ​ (Figure4) .4). Les concentrations plasmatiques, telles qu'estimées à partir des animaux satellites non implantés, se situaient entre 3 et 4 μ M. Les effets sur le sillage actif chez les rats par 12 étaient similaires à ceux observés lorsque 9, 10 ou 11 ont été dosés à 10 mpk (données non montrées). De plus, l'effet sommeil / éveil des quinazolinones 9 et 12 est similaire aux pipéridines structurellement distinctes 1 et 2, ainsi que l'antagoniste de type T récemment rapporté TTA-A2,32 suggérant l'implication commune des canaux calciques de type T . Un compte rendu complet des effets des antagonistes des canaux calciques de type T sur l'architecture du sommeil sera présenté prochainement33. Effet de 12 sur le sommeil actif du rat mâle N = 7 pendant 23 h après l'administration de 10 mg / kg de po. Les données sont des minutes moyennes de sillage actif dans chaque période de 30 min (± SEM) commençant à l'heure de la dose (triangle gris). En conclusion, le score HTS de quinazolinone 3 a été optimisé pour la puissance sur le canal de type T, la pénétration dans le cerveau et la biodisponibilité tout en minimisant les activités auxiliaires telles que l'inhibition et l'induction du CYP. Les quinazolinones optimisées 10 et 12 ont un profil in vivo robuste de suppression des crises et des tremblements ainsi qu'une suppression active du sillage chez les rats.La localisation des canaux calciques de type T dans les circuits thalamocorticaux couplée avec les effets in vivo similaires des classes d'inhibiteurs structurellement distincts suggère un rôle critique pour la modulation des canaux calciques de type T des processus importants du SNC y compris l'épilepsie, les tremblements et le sommeil.