La thérapie à l’entécavir induit une mutation de Novo-VIH par transcriptase inverse du VIH chez un patient naïf de traitement antirétroviral

Récemment, l’entecavir a été introduit comme un puissant médicament contre l’infection par le virus de l’hépatite B Initialement, il a été suggéré de ne pas avoir d’effet sur l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine. Chez des patients naïfs de traitement antirétroviral co-infectés par le VIH et le virus de l’hépatite B Après des semaines de traitement par l’entécavir, la mutation MV a dominé la population virale plasmatique. l’entecavir ne doit être utilisé que chez les patients co-infectés recevant simultanément une thérapie suppressive contre l’infection par le VIH

Virus de l’hépatite B L’hépatite B est l’une des principales causes d’hépatite chronique, de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire et constitue un grave problème de santé dans le monde, avec un nombre estimé de millions de personnes infectées chroniquement . de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire Le traitement avec des analogues nucléosidiques supprime l’ADN du VHB à de faibles taux, réduisant l’inflammation et le risque de lésions hépatiques et de carcinome hépatocellulaire Deux analogues nucléosidiques ont été utilisés: lamivudine et adéfovir dipivoxil, tous deux bien tolérés ces médicaments sont cependant relativement faciles à mettre au point conception. Pour la lamivudine en monothérapie, la résistance est développée en% des personnes après des années de traitement Pour l’adéfovir,% de personnes ont développé une résistance pendant une année de suivi . pour le traitement de l’infection chronique par le VHB Comparé aux autres analogues nucléosidiques, le développement En outre, l’entecavir conserve son efficacité contre les virus résistants à la lamivudine et à l’adéfovir Le traitement par l’entécavir a été déclaré n’avoir aucun effet sur l’infection par le VIH. Cependant, récemment, McMahon et al ont montré que l’entécavir avait un effet sur la réplication du VIH in vitro et a sélectionné la mutation de la transcriptase inverse MV dans le virus chez les patients infectés par le VIH. Les deux patients avaient été traités avec la lamivudine; Ainsi, le mutant MV pourrait être un mutant réintroduit de virus archivés sélectionnés lors d’un traitement antérieur. En conséquence, les recommandations ont été récemment modifiées Dans notre étude, nous avons démontré que l’entécavir peut induire la mutation MV chez un patient infecté par le VIH naïf Les échantillons de plasma, conservés à-° C, ont été analysés rétrospectivement. Les échantillons ont été prélevés avant le début du traitement par le VHB avec l’adéfovir, pendant le traitement, avant que l’entécavir ne soit administré. L’ARN du VIH a été extrait du plasma à l’aide du kit d’ARN viral QIAamp QIAamp, conformément à la procédure du fabricant. Un segment du gène pol a été amplifié dans un RT-PCR SuperScript III de -uL -step. Taq HIFI polymérase; Invitrogen, comme décrit ailleurs

Le temps d’induction de la mutation adéfovir est noté. L’analyse des échantillons de PBMC a été incluse pour la dernière fois. L’ADN génomique a été extrait de × cellules / mL en utilisant le mini kit QIAamp QIAamp, et l’ADN proviral a été amplifié par PCR. en utilisant une méthode similaire à celle décrite ci-dessusHBV Quantification de l’ADN a été réalisée par une méthode interne en utilisant des balises moléculaires sur un système de PCR en temps réel MxP Stratagène Tous les échantillons ont été analysés dans des extractions indépendantes et analyses Le QIAmp Virus BioRobot kit Qiagen selon les instructions du fabricant et a été élué avec μL d’eau. Les amorces HBV-Ab et HBV-Bb ont été sélectionnées dans la région précore, amplifiant un produit de la position des paires de bases – Dix microlitres d’ADN échantillon ou standard externe ajouté à μL de mélange réactionnel contenant mmol / L tris chlorhydrate pH,, mmol / L de chlorure de potassium, mmol / L de chlorure de magnésium,% de Tween, μmol / L deoxyri La PCR a été réalisée en utilisant des cycles pour s à ° C, s à ° C et s à ° C. La limite de détection était de ~ copies / ml d’UI / ml. Les échantillons de PCR ont été dilués à une concentration de ~ Copies virales et ont été utilisées dans un système de mutation de réfraction d’amplification décrit ailleurs En bref, une amorce directe non spécifique et une amorce inverse, spécifique soit de type sauvage MV ou mutant, ont été mélangées avec le produit PCR, sonde TaqMan et Fast Start Mélange DNA Master Hybridization Roche Diagnostics Les échantillons ont été analysés sur LightCycler, version Roche Diagnostic, et la quantification relative des populations MV ou mutantes a été réalisée. Nous avons examiné des clones, y compris un fragment généré par PCR nucléotidique du gène de l’enveloppe points temporels Chaque fragment a été cloné dans le plasmide TOPO-pCR en utilisant le système de vecteur TOPO par Invitrogen, selon le protocole du fabricant. Chaque clone purifié a été séquencé en usin g BigDye, version Applied Biosystems, sur un ABI Un arbre phylogénétique voisin a été réalisé en utilisant PHYLIP, version La robustesse de l’arbre a été évaluée par bootstrap avec resamplingsResults Le patient était un homme blanc d’un an avec co-infection VIH-HB Il Testé positif pour l’antigène de surface de l’hépatite B et l’antigène précoce de l’hépatite B dans et pour l’infection par le VIH Dans la numération des lymphocytes T CD du patient était un nombre moyen élevé de cellules T CD, cellules / μL; gamme, – cellules / μL, et sa charge plasmatique de VIH était une charge VIH moyenne stable, copies / mL; Le patient ne répondait pas aux critères de mise sous TAR Une biopsie du foie a été pratiquée et n’a révélé qu’une activité mineure liée à une infection chronique par le VHB. Le patient a refusé une deuxième biopsie hépatique avant septembre, lorsqu’il a développé une cirrhose. Le traitement par l’adéfovir a débuté en mars et la mesure régulière des taux sériques de foetoprotéine α et des ultrasons du foie a été utilisée pour surveiller le développement du carcinome hépatocellulaire. Le taux d’ADN du VHB du patient a diminué de 1/5 copies / mL en L’année suivante, cependant, son taux d’ADN du VHB a augmenté de log copies / mL, et le séquençage du génome a détecté la mutation adéfovir NT. Comme il n’y avait toujours pas besoin de commencer le traitement, il a été décidé de traiter l’infection par le VHB seul. traitement par l’adéfovir en novembre Après cet ajout au schéma thérapeutique du patient, son taux d’ADN du VHB a baissé à un niveau indétectable. Simultanément, son taux viral plasmatique du VIH Les résultats récents suggèrent que la mutation MV pourrait être induite ou réactivée par l’entecavir. Par conséquent, un test de génotypage de routine du VIH ViroSeq, version ; Celera Diagnostics a été réalisée en avril Le test a identifié la mutation MV dans le gène de la transcriptase inverse du VIH Pour déterminer la relation exacte entre le développement de la mutation MV et le traitement par entécavir, des échantillons de plasma ont été analysés pour détecter la mutation MV avant, pendant et après l’introduction du traitement par l’entecavir, en utilisant un système de mutation de réfraction d’amplification hautement sensible. Cette étude a montré que les virus porteurs de la mutation MV apparaissaient rapidement dans le plasma après le début du traitement par entécavir chez un patient naïf. quelques mois de traitement Avant le début du traitement par entécavir, seules les populations séropositives de type sauvage pouvaient être détectées Après des semaines de traitement par l’entécavir, la proportion des populations de VIH plasmatiques contenant la mutation MV augmentait à% et% les résultats du génotypage effectué en avril En outre, l’analyse des échantillons de PBMC à partir des derniers points semaines et après l’initiation de l’entécavir a révélé que le pourcentage de génomes proviraux portant la mutation MV a augmenté de% à% figure A

Figure Vue largeDownload slideQuantification de la mutation MV A, La fraction de type sauvage et le mutant MV dans le virus des échantillons plasmatiques à différents moments Le moment de l’initiation de l’entecavir est noté B, La méthode de distance voisine arbre phylogénétique de l’enveloppe gène isolats générés à différents moments, comme suit: rouge de mars, vert d’octobre, bleu de mars et jaune d’avril La valeur de bootstrap a été définie à la vue de la figure largeDownload slideQuantification de la mutation MV A, La fraction de type sauvage et le mutant MV dans le virus de Échantillons plasmatiques à différents moments Le moment de l’initiation du traitement par l’entécavir est noté B, La méthode de la distance voisine de l’arbre phylogénétique des isolats du gène de l’enveloppe générés à différents moments, comme suit: mars rouge, vert octobre, bleu mars et jaune avril Nous avons construit un arbre phylogénétique d’isolats d’enveloppe clonés à partir d’échantillons espacés dans le temps. Isolats viraux de semaines et avec un Les mutations MV de% et de%, respectivement, étaient distinctes des isolats précurseurs précoces de la figure B, bien qu’elles se soient groupées par intermittence avec des isolats testés au début de l’entécavir. chez un patient naïf d’ART et a dominé la population virale dans le plasma après des mois de traitement. Le même développement, avec un certain retard, a été observé dans l’ADN proviralNotre patient différait de ceux étudiés en détail par McMahon et al Dans cette étude, mutant a été récupéré du virus dans des échantillons de sérum de patients, tous deux recevant un traitement antirétroviral comprenant de la zidovudine et de la lamivudine pendant plusieurs années avant le début du traitement par entécavir. Ainsi, chez ces patients, les virus précédemment archivés avec la mutation MV ont probablement été réactivés. Dans notre étude, l’infection par le VIH, y compris la mutation MV, semblait très improbable, car il n’avait jamais Par conséquent, l’entécavir semble avoir induit la mutation MV de novo. La seule autre explication est une réactivation d’une surinfection acquise, ce qui n’a pas été confirmé par l’utilisation de la lamivudine. la relation phylogénétique BL’analyse phylogénétique soutient l’observation que l’entécavir a induit la mutation MV Il y avait un haut degré d’homologie entre les isolats viraux à l’initiation et pendant le traitement à l’entecavir et une nette distinction des isolats précurseurs précoces. Ceci suggère que les populations virales avec MV En outre, nous avons observé une introduction rapide de génomes portant la mutation MV dans le pool d’ADN proviral, suggérant une pression sélective par le traitement par l’entecavir in vivo. Nous notons que la mutation a évolué au cours de la période menstruelle après le début du traitement par entécavir. une diminution des taux d’ARN du VIH après traitement par l’entécavir a été initiée Cette corrélation avec l’apparition de la mutation MV Cette diminution pourrait avoir eu lieu soit en raison d’un effet inhibiteur de l’entécavir sur la capacité de réplication du VIH ou d’une perte de fitness par le mutant du virus MV, comme décrit ailleurs. ont démontré l’induction de la mutation MV chez un patient naïf infecté par le VIH et traité par entécavir pour co-infection par le VHB Les résultats indiquent que la mutation MV a été introduite de novo Ainsi, le traitement par entécavir ne doit pas être utilisé pour traiter l’infection -naive, patients infectés par le VIH

Remerciements

Nous remercions Jonna Guldberg et Erik Hagen Nielsen pour leur excellente assistance technique et la clinique externe du Département des maladies infectieuses de l’hôpital universitaire d’Aarhus, à Skejby, pour leur aide à la collecte d’échantillons sanguins. Fondation danoise pour le sida, Fondation scandinave pour la chimiothérapie antimicrobienne Augustinus Foundation Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits