Un pyrimidinol multifonctionnel optimisé Quencher radical

La dysfonction mitochondriale est liée à de nombreux neurodégénératives

les maladies, y compris la maladie d’Alzheimer, Parkinson ’ s

La maladie de Huntington et les ataxies de Friedreich sont des organites d’importance vitale

fonctions cellulaires, notamment le métabolisme énergétique. Ils produisent 90% de

notre ATP cellulaire par phosphorylation oxydative dans la mitochondrie

chaîne respiratoire.7 − 11 Au sein des mitochondries, le site primaire des espèces réactives de l’oxygène

(ROS) génération est la chaîne de transport d’électrons; 12,13 normalement, les mitochondries ont un vaste réseau d’antioxydants

et les systèmes de désintoxication, assurant que la peroxydation lipidique et les niveaux

de ROS sont maintenus à des niveaux physiologiquement acceptables.14,15 Les défauts de la chaîne respiratoire mitochondriale peuvent indubitablement

à une augmentation des fuites d’électrons et par conséquent à une augmentation de la production de ROS,

causant des dommages oxydatifs progressifs et, finalement, la mort cellulaire. 2 − 5,10,16Les effets antioxydants et bioénergétiques de la coenzyme Q (CoQ10) sont bien connus, 17,18 mais son utilité clinique

est limité par son hydrophobicité extrême, ce qui entraîne une faible biodisponibilité.19,20 Faciliter la livraison de telles molécules aux mitochondries

des cellules, nous avons conçu des antioxydants portant plus petit lipophile

chaînes latérales et ayant pyrimidinol21 ou

pyridinol22 − 26 noyaux d’oxydo-réduction, basés sur des études antérieures27 − 30 Nous avons démontré qu’un analogue d’aza

d’idébénone (3, figure ​ figure1), 1), ayant

le noyau de 1,4-benzoquinone remplacé par un noyau de pyrimidinol, retenu

la capacité de fonctionner à l’intérieur des mitochondries.21 Parce que ces analogues aza fonctionnent à plusieurs niveaux

pour supprimer les dommages qui seraient autrement causés par une fuite d’électrons

de la chaîne de transport d’électrons, nous les avons désignés multifonctionnels

trempe radicale.21 Récemment, nous avons décrit

l’importance de l’optimisation de la chaîne latérale pour améliorer l’activité antioxydante

et la capacité à maintenir les niveaux d’ATP dans la maladie mitochondriale cellulaire

modèles en comparaison avec 3.26 Ces résultats encourageants suggèrent que l’optimisation

le noyau redox et la chaîne latérale pourraient permettre radicalaire multifonctionnel

trempe présentant une puissance et une efficacité améliorées.Figure 1Structures of compounds

synthétisés et étudiés.Présent, nous décrivons la préparation et la caractérisation

de six nouveaux dérivés de pyrimidinol (4 – 9). Ces composés ont des noyaux redox différents de ceux précédemment

rapporté 3; 21 le groupe méthyle

ortho à l’OH phénolique a été remplacé par un groupe méthoxy.

Ils ont également des chaînes latérales modifiées de différentes longueurs manquant de la

groupe hydroxyle présent dans l’idébénone et 3 (Figure ​ (Figure1) .1). Les composés 1 – 9 ont été évalués pour leur capacité à supprimer la peroxydation des lipides,

maintenir le potentiel membranaire mitochondrial, conférer la cytoprotection

cellules cultivées sous stress oxydatif induit, et support électronique

transport à travers la chaîne respiratoire comme jugé par une augmentation de

Les niveaux d’ATP.La préparation de 1 et 3 ont été décrites précédemment.21,31 Decylubiquinone

(2) était disponible dans le commerce. Les synthèses du

2- (N, N-diméthylamino) -4-alkyl-6-méthoxypyrimidine-5-ols

(4, 5 et 7) ont été accomplis

en utilisant la stratégie illustrée dans le schéma 1 pour 7 et son acétate 7a. Ceux-ci ont été préparés en

quatre et cinq étapes, respectivement. Premièrement, la 2-amino-6-méthoxy-4-méthylpyrimidine disponible dans le commerce

a été traité avec de l’iodure de méthyle en présence d’hydrure de sodium

permettre 10 dans 63% de rendement. Ensuite, 10 ont été monoalkylés

sur le groupe méthyle C-4 par traitement avec n-BuLi

en présence de bromure de pentadécyle, ce qui donne 11

62% de rendement. L’aminopyrimidine 11 a ensuite été bromée à

position 5 pour obtenir la 5-bromo-2- (N, N-diméthylamino) -4-hexadécyl-6-méthoxypyrimidine

(12) en rendement de 95%. Finalement, 7 ont été obtenus

avec un rendement de 55% en traitant 12 successivement avec du n-BuLi en présence de N, N, N, N, N-tétraméthylènediamine (TMEDA), puis avec du borate de triméthyle, et enfin

avec du peroxyde d’hydrogène. Le composé 7 a été O-acétylé avec un rendement de 80% pour obtenir 7a.Scheme 1Route Employed

pour la synthèse de 7 et de son acétate (7a) Les composés 4 et 5 ont été préparés de la même manière, en utilisant les

bromures d’alkyle pour l’alkylation de l’intermédiaire 10 (Scheme

S1, Informations à l’appui). Pour la préparation

de 6, 8 et 9, un peu

stratégie différente a été employée (Schéma S2, Soutien

Information) invasif. Spécifiquement, l’alkylation de 10 a été réalisée avec du bromure d’allyle, donnant la 2- (N, N-diméthylamino) -4- (3-butényl) -6-méthoxypyrimidine.

en 50% de rendement. Après la conversion de ce composé en intermédiaire clé

La 5-benzyloxy-2- (N, N-diméthylamino) -4- (3-butényl) -6-méthoxypyrimidine,

les chaînes latérales de 6, 8 et 9 ont été introduites par des réactions de métathèse croisée en utilisant les

alcènes terminaux et Grubbs ’ catalyseur de deuxième génération.32 La caractérisation de tous les nouveaux composés inclus

spectrométrie de masse à haute résolution. L’antioxydant et la bioénergétique

les propriétés des analogues de pyrimidinol nouvellement préparés ont été testées

et analysé dans des dosages biochimiques et biologiques sélectionnés. Le test

composés ont été dissous dans du DMSO et ajoutés au milieu d’essai à

concentrations finales de DMSO < 0,5%. La capacité du pyrimidinol

analogues pour étancher la peroxydation lipidique ont été étudiés dans les lymphocytes FRDA

qui avait été appauvri en glutathion par traitement au maléate de diéthyle

(DEM). Le lipide fluorescent peroxydant sensible à l’acide gras conjugué

colorant (C-11-BODIPY581 / 591) a été utilisé comme décrit

La figure 22 montre le FACS représentatif C11-BODIPY581 / 591-vert (oxydé) FACS (activé par fluorescence).

tri cellulaire) superpositions d’histogrammes de cellules lymphocytaires FRDA colorées

avec C11-BODIPY581 / 591-rouge (réduit) et analysé

en utilisant le canal FL1-H, comme décrit dans le

Information. Le traitement par le DEM a provoqué le déplacement de la fluorescence verte C11-BODIPY581 / 591 vers l’axe des x de l’histogramme FACS, indiquant une augmentation de la peroxydation de la membrane.

à la suite de l’épuisement du glutathion. Optimisation du noyau redox

en remplaçant le groupe méthyle ortho par le groupe phénolique OH (3) par un meilleur groupe donneur d’électrons (méthoxyle), comme en 4, augmente significativement sa capacité à inhiber la peroxydation des lipides

(Figure ​ (Figure2) .2). Ces résultats sont en accord

avec la capacité de plus de groupes donneurs d’électrons à abaisser la liaison

énergie de dissociation de la liaison O – H, telle que décrite par Valgimigli

et al.33 Nous avons récemment rapporté le

importance de la longueur de la chaîne latérale sur l’interaction des analogues de la coenzyme Q

avec la chaîne respiratoire mitochondriale pour atteindre l’antioxydant amélioré

À la lumière de ces constatations,

nous avons préparé des analogues ayant différentes longueurs de chaînes latérales attachés

au noyau redox modifié. Comme montré (Figure ​ (Figure2), 2), la longueur optimale pour l’activité antioxydante était entre 14 et

16 atomes. L’analogue avec une chaîne latérale octadécyl (8) avait une capacité significativement réduite à éteindre la peroxydation lipidique

en comparaison avec les chaînes latérales de 14 et 16 atomes (6, 7 et 9). Figure 2 Peroxydation lipidique dans les lymphocytes FRDA

des cellules appauvries en glutathion ont été détectées en utilisant le

sonde d’acide gras C11-BODIPY581 / 591 (acide 4,4-difluoro-5- (4-phényl-1,3-butadiényl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène-3-propionique)

en utilisant FACS. … La capacité du pyrimidinol

analogues pour préserver l’intégrité de la membrane mitochondriale après le traitement

des lymphocytes FRDA avec du maléate de diéthyle (DEM) a été évaluée par FACS

analyse du potentiel de la membrane mitochondriale (Δ ψ m) en utilisant la sonde fluorescente cationique tetramethylrhodamine methyl

ester (TMRM), comme décrit précédemment.24,25

analyses de parcelle de point de densité de couleur bidimensionnelle cytométrique de flux de

les mesures potentielles de la membrane mitochondriale en présence

et l’absence de composés sélectionnés sont montrés (panneau supérieur, Figure ​ Figure3) .3). Le pourcentage de cellules colorées par TMRM intactes

potentiel de la membrane mitochondriale apparaît dans le quadrant supérieur droit

de traitements individuels. Cyanure de carbonyle 4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone

(FCCP), un découpleur communément utilisé de la phosphorylation oxydative dans

mitochondrie, a été utilisé comme contrôle positif pour dissiper la chimiosmotique

gradient de protons, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence TMRM

un résultat de la dépolarisation du potentiel de la membrane interne mitochondriale.

Le graphique à barres dans le panneau inférieur de la figure 33 résume le pourcentage des cellules avec des profils cytométriques en flux intacts. Cela montre clairement que 6, 7 et 9 avaient la plus grande puissance.

Composé 4, ayant la chaîne latérale idébénone, était légèrement

mieux que le composé 3 dans ce test. Idébénone était moins

actif que 3 ou 4 (Figure ​ (Figure3) .3). Decylubiquinone (2) et 5 ont permis

protection significative de l’intégrité de la membrane mitochondriale, comme indiqué

dans la figure ​ Figure3.3. Composé 8, ayant

une chaîne latérale de carbone 18, était aussi efficace que 3 et 4.Figure 3Déclaration représentative du flux de densité de couleur bidimensionnelle de flux

analyses parcellaires de la capacité de 1 – 9 à maintenir le potentiel de la membrane mitochondriale (Δ ψ m) dans des cellules de lymphocytes FRDA traitées par DEM colorées avec 250 nM

TMRM et analysé … La capacité des composés à protéger les fibroblastes cutanés FRDA

de la mort induite par les dommages oxydatifs a été mesurée comme décrit précédemment

avec quelques modifications.34,35 Les cellules ont été soumises

à la l-buthionine (S, R) -sulfoximine

(BSO), un inhibiteur de la biosynthèse de novo glutathion (GSH) .36 Les concentrations efficaces demi-maximales (CE50) ont été déterminées (tableau 1). Oxydatif

mort induite par les dommages des fibroblastes FRDA a été bloquée par exogène

antioxydants.34,35 Les composés 6, 7 et 9 étaient de loin les plus efficaces,

Valeurs EC50 de 22 ± 7, 25 ± 4 et 32 ​​±

4 nM, respectivement (Tableau 1). Encore une fois, dans ce

La longueur optimale de la chaîne latérale était comprise entre 14 et 16 atomes. Composés

avoir une chaîne latérale avec moins de 14 ou plus de 16 atomes étaient moins

protecteur dans ce test. Les composés 3 et 4, ayant la chaîne latérale d’idébénone, étaient tous deux plus efficaces que

idébénone, mais moins efficace que la décylubiquinone et 5 (tableau 1). Tableau 1 Effet du pyrimidinol

Antioxydants sur la viabilité cellulaire des fibroblastes FRDA traités

avec BSO Dans cette étude, nous avons utilisé un dépistage sensibilisé aux nutriments

stratégie pour identifier les analogues de la CoQ10 qui fonctionnent

la chaîne respiratoire mitochondriale en mesurant le niveau total d’ATP

dans les milieux contenant du galactose.37 Total

L’ATP cellulaire a été mesurée dans des cultures de FRDA et de CoQ10 déficientes

lignées cellulaires telles que décrites précédemment.26

les cellules ont été cultivées sur un milieu sans glucose additionné de galactose.

Puisque les cellules cultivées en galactose dépendent principalement de la phosphorylation oxydative

(OXPHOS) pour produire leur ATP, ils deviennent plus sensibles aux mitochondries

inhibiteurs de la chaîne respiratoire que les cellules cultivées dans le milieu glucose.37,38 Le composé 7 et son acétate (7a) ont augmenté

Niveaux d’ATP dans les lymphocytes déficients en CoQ10 au-dessus de la

niveau de base lorsqu’il est utilisé aux concentrations de 5 et 10 μ M et légèrement

abaissé les niveaux d’ATP dans les deux lignées cellulaires à 25 μ M (Tableau 2). Idebenone fortement diminué les niveaux d’ATP dans un

mode dépendant de la concentration dans le déficit en CoQ10

lymphocytes, ainsi que dans les lymphocytes de l’ataxie de Friedreich

(Tableau 2). En présence de 25 μ M idebenone,

Les concentrations d’ATP étaient essentiellement complètement épuisées. Décylubiquinone

(2), qui diffère de l’idébénone uniquement par l’absence

du groupe OH de la chaîne latérale, a montré un taux d’ATP réduit de 37% à

25 μ M concentration par rapport au contrôle. Il n’y avait pas d’augmentation

en concentrations d’ATP aux concentrations les plus faibles (5 et 10 μ M)

le niveau basal. La réduction des taux d’ATP chez les patients traités par l’idébénone

cellules reflète probablement la capacité de l’idébénone à inhiber complexe

I activité dans la chaîne de transport d’électrons mitochondriale, comme nous l’avons

montré précédemment dans les mitochondries du cœur de bovins26. Notre étude antérieure suggérait que les composés lipophiles

chaînes latérales montrent une moindre inhibition de la respiration respiratoire mitochondriale

complexes de chaîne et permettre ainsi une maintenance plus efficace

des taux d’ATP cellulaire.26 Dans cette étude,

deux analogues de pyrimidinol ayant des chaînes latérales lipophiles ont été montrés

être capable d’augmenter les niveaux d’ATP dans les lymphocytes déficients en CoQ10,

mais pas dans les lymphocytes de l’ataxie de Friedreich, lorsqu’ils sont utilisés

Concentration totale en ATP de 2Total dans les lymphocytes déficients en CoQ10 et les lymphocytes FRDA après l’incubation

avec les composés 1 – 9 pendant 48 h Dans la présente étude, 1 – 9 ont été évalués

pour leur capacité à améliorer les niveaux d’ATP en déficience en CoQ10

lymphocytes et dans les lymphocytes FRDA. Comme noté ci-dessus, l’idébénone (1) et la décylubiquinone (2) ont simplement diminué

Les niveaux d’ATP dépendent de la concentration. Le composé 3, qui était inclus dans l’étude antérieure, 26 a eu le même effet que le composé 4. Composé 5, ayant un substituant 6-méthoxy sur le noyau redox et un 4-décyle

substituant noté comme étant sous-optimal pour les dosages décrits ci-dessus,

également échoué à augmenter les niveaux d’ATP. Composé 8, dont

chaîne latérale s’est révélée être sous-optimale dans les tests décrits ci-dessus,

a été trouvé sans effet sur les niveaux d’ATP dans l’un ou l’autre des lymphocytes

lignées cellulaires étudiées. En comparaison, 6, 7, 7a et 9 ont tous eu un effet statistiquement significatif

augmentation des niveaux d’ATP lors de l’essai à 5 μ concentration de M dans

les deux lymphocytes déficients en CoQ10 et les lymphocytes FRDA.

La réponse la plus favorable a été notée pour 7 lymphocytes déficients en CoQ10, à savoir 118 ± 2% de contrôle.

La lignée cellulaire utilisée pour cette expérience (GM17932, Coriell Cell Repository)

a été montré précédemment pour avoir un niveau d’ATP qui est inférieur d’environ 20%

Les rôles importants de la CoQ10 dans les mitochondries 17,18, nous avons évalué les effets de l’idébénone (1), 4 et 7 sur les fibroblastes FRDA dans lesquels la CoQ10 avait été appauvri pharmacologiquement. Traitement de mammifères cultivés

cellules avec 4-nitrobenzoate, qui inhibe de manière compétitive

4-hydroxybenzoate: polyprenyltransférase (COQ2), 39 a été signalé pour diminuer la biosynthèse CoQ10

comparé au témoin39 − 41 Traitement analogue des fibroblastes FRDA avec 1 mM

4-nitrobenzoate appauvri les niveaux de CoQ10 de 29% par rapport à

contrôle (Figure S1a, Informations de support) et réduction des niveaux d’ATP de 20% par rapport au contrôle (Figure S1b, Informations de support). Co-traitement de FRDA

fibroblastes avec 1 mM 4-nitrobenzoate et 5 μ M composé 7 restauré ATP, essentiellement à des niveaux normaux (figure S2, information de soutien), tandis que 4 ayant la chaîne latérale idébénone était moins efficace à 5 μ M

concentration et inefficace à 10 μ M concentration. Idebenone

elle-même diminue les niveaux d’ATP avec ou sans coadministration de 4-nitrobenzoate.

Il a été rapporté que l’ajout de décylubiquinone (2) aux cellules traitées au 4-nitrobenzoate augmentait significativement la respiration

En résumé, de nouveaux dérivés du pyrimidinol ont été synthétisés

caractérisé biochimiquement. Les résultats indiquent qu’une optimisation soigneuse

du noyau redox et de la chaîne latérale peuvent se permettre radicalaire multifonctionnel

des extincteurs capables de supprimer efficacement les ROS et la peroxydation lipidique,

préserver le potentiel de la membrane mitochondriale, permettant la cytoprotection

contre le stress oxydatif induit, et le maintien des niveaux normaux d’ATP.

Les activités cytoprotectrices grandement améliorées des présents composés

capable d’améliorer la production d’ATP, en comparaison avec le prototype

analogue 3, suggère que l’activité optimale résulte de

propriétés multiples des composés dans la suppression de la peroxydation lipidique

et ROS, en plus d’améliorer la production d’énergie, compatible avec

notre hypothèse mécaniste antérieure.21

le nombre limité d’analogues étudiés ici ne définit pas complètement

la chaîne latérale et le noyau redox optimal pour améliorer l’antioxydant et

propriétés bioénergétiques, il suggère que d’autres optimisation structurelle

peut donner des composés appropriés pour une intervention thérapeutique dans les mitochondries

et les maladies neurodégénératives associées à des niveaux accrus de

ROS et production d’énergie réduite.