Synthèse et évaluation de Noviose Replacements sur Novobiocin Cette activité antiproliférative manifeste

Les protéines de choc thermique de 90 kDa (Hsp90) sont responsables de la maturation conformationnelle. de plus de 200 protéines client Hsp90-dépendantes dont 1,2 dont Her2, Src kinases de la famille, Raf, PLK, RIP, AKT, télomérase, et Met sont directement associés aux six caractéristiques du cancer.3,4 Par conséquent, l’inhibition de la machinerie de repliement des protéines Hsp90 perturbe simultanément plusieurs voies oncogéniques, conduisant à la mort cellulaire.5,6 Depuis le premier médicament de preuve de concept, le 17-AAG (un analogue synthétique de la geldanamycine) est entré en essais cliniques et a démontré un bénéfice thérapeutique à des doses tolérables. 7, des recherches approfondies ont conduit à plus de 20 essais cliniques ultérieurs, 8 mettant en évidence Hsp90 comme une cible thérapeutique prometteuse pour le développement d’agents anticancéreux.9 − 11Novobi L’ocine, un produit naturel composé d’un sucre de noviose, d’un noyau de coumarine et d’une chaîne latérale de benzamide prénylée, est isolé des souches Streptomyces12 et est connu pour présenter une activité antimicrobienne en se liant à la poche de liaison à l’ATP de l’ADN gyrase. En raison de la conformation courbée similaire présentée par l’ADP lié à la fois à l’ADN gyrase et au domaine N-terminal Hsp90, Neckers et collaborateurs ont émis l’hypothèse que la novobiocine peut manifester une activité anticancéreuse par inhibition de Hsp90. 15 Leurs études pionnières ont révélé que la novobiocine se lie à Hsp90, mais au lieu de se lier au domaine N-terminal bien reconnu, elle se lie à une région C-terminale non reconnue, quoique avec une faible affinité (∼ 700 μ dans les cellules SKBr3) .15 Depuis cette étude, des modifications structurales de la novobiocine ont été poursuivies afin d’identifier les molécules qui présentent une activité inhibitrice accrue.16 − 22La première banque de ces composés Yu et ses collègues ont conçu et synthétisé les fonctionnalités nécessaires à l’inhibition de Hsp90 sur l’anneau coumarinique et la chaîne latérale benzamidique de la novobiocine.17 Leurs études ont révélé que l’appendice noviose se fixait en position 7 du coumarine et d’un amide. le lieur en position 3 est critique, tandis que le substituant 4-hydroxy et le 3 ′ -carbamoyle sont préjudiciables. Le composé le plus efficace identifié à partir de cette banque était le composé A4, qui induisait une dégradation des protéines client dépendant de Hsp90 à une concentration inférieure de 70 fois à celle de la novobiocine. Curieusement, le composé A4 a induit la réponse au choc thermique à des concentrations inférieures de 1000 fois à celles requises pour la dégradation des protéines du client.23,24Pour confirmer si les tendances de structure et de relation d’activité (SAR) observées par Yu et ses collègues étaient conformes au produit naturel, DHN2 a été synthétisé pour délimiter les fonctionnalités responsables de l’ADN gyrase contre l’inhibition de Hsp90.18 Cet analogue de novobiocine a confirmé que le 4-hydroxyle et le 3 ′ carbamate sont préjudiciables à l’activité inhibitrice de Hsp90 mais critiques pour l’inhibition de l’ADN gyrase, confirmant ainsi les tendances SAR observées pour A4.Les modifications structurelles subséquentes et les études SAR ont exploré la chaîne latérale de la coumarine et de la benzamide, et plusieurs composés de type plomb ont été identifiés et restent à l’étude.19,21,22 Comme le montre la figure ​ Figure 1.1, les analogues préparés jusqu’ici conservent l’appendice noviose. Cependant, la synthèse de noviose est laborieuse et entrave le développement des analogues, car elle nécessite plus de 10 étapes pour se préparer et s’activer pour un couplage ultérieur avec le phénol coumarine.25,26 Reconnaissant le SAR limité pour cette fraction et sa préparation encombrante, des analogues simplifiés ont été poursuivi dans un effort pour augmenter l’activité tout en augmentant simultanément la solubilité. Dans cet article, nous fournissons les premières substitutions biologiquement actives pour l’appendice noviose sur la novobiocine et les premiers mimétiques non glucosiques qui présentent une activité antiproliférative accrue.Figure 1SAR généré à partir des enquêtes précédentes.Il est bien entendu que les fragments de sucre dans les produits naturels jouent un rôle clé dans la solubilité, l’activité et la biodisponibilité de ces composés. En outre, la taille de l’anneau peut conférer une affinité significative envers leur protéine apparentée. En tenant compte de ces considérations, on a synthétisé une série de sucres de furanose et de pyranose mono- et dihydroxylés (Schéma 2) selon les procédures décrites précédemment26 pour incorporation sur l’échafaudage de novobiocine, 10. La préparation de 10 est décrite dans Schéma 1. Le phénol coumarine 6 a été converti en éther de méthoxyméthyle (MOM) en utilisant du chlorure de MOM et de la base de Hunig dans du diméthylformamide. L’aniline libre, libérée par hydrogénolyse avec du Pd / C à 10% et de l’hydrogène dans du tétrahydrofurane à partir de 7, a été couplée avec du chlorure d’acide 8 pour donner du benzamide 9.Le clivage subséquent de l’éther de MOM avec du chlorhydrate 4N dans du dioxane donne le phénol 10 avec un rendement élevé effet. Préparation du Coumarin Phénol 10 Une fois préparé, le phénol de 10 est couplé avec les sucres dans des conditions de Mitsunobu pour donner un mélange diastéréoisomère inséparable de 11 − 13 et 15 (Schéma 2). Dans le cas du composé 14, un seul diastéréoisomère a été formé. L’hydrolyse subséquente des carbonates cycliques et des esters acétyliques de 11a, b et 14 avec de l’hydroxyde de lithium dans THF / MeOH / H20 (3: 2: 2, v / v) a donné un mélange diastéréoisomère de 16a, b et 19, respectivement. A ce stade, les diastéréoisomères 16a et 16b ont été séparés par chromatographie sur silice. L’attribution de la stéréochimie au centre anomérique a été établie par des études RMN bidimensionnelles utilisant la spectroscopie à effet Overhauser nucléaire. L’hydrolyse du benzoyle et de l’ester acétylique de 12 avec du methanol basique donne 17a et 17b, qui peuvent être séparés par Chromatographie sur silice. Les groupes tri-isopropylsilyle de 13 et tert-butyldiméthylsilyle de 15 ont été éliminés par addition de fluorure de tétrabutylammonium pour donner respectivement 18a et 18b et 20a et 20b séparables.Synthèse 2 d’analogues de novobiocine contenant des furanoses mono- et dihydroxylées et des pyranoses les substituts de noviose, les composés ont été soumis à l’évaluation de l’activité anti-proliférative contre SKBr3 (cellules de cancer du sein surexprimant le récepteur d’œstrogène négatif, Her2) et MCF-7 (cellules de cancer du sein positives au récepteur d’œstrogène). Comme le montre le tableau 1, les analogues du sucre à six chaînons (16a, 18a et 16b et 18b) se sont révélés plus puissants que leurs homologues à cinq chaînons (19 et 20a, b). Le composé 18b a affiché une valeur CI50 de 3,11 ± 0,03 et 1,56 ± 0,20 μ M contre les lignées cellulaires SKBr3 et MCF-7, respectivement, qui est 8 fois plus active que DHN2 (Tableau 1) et ∼ 200 fois plus grande que l’activité manifestée par la novobiocine. De façon surprenante, la stéréochimie de ces imitations de sucre n’était pas critique pour l’augmentation observée de l’activité antiproliférative, étant donné que les deux anomères α – (16b) et β (17a) produisaient des activités similaires. Le placement du groupe hydroxyle (3 ′ -OH ou 4 ′ -OH) sur le cycle éthéré n’a pas non plus donné d’activité préférentielle.Tableau 1Activités Antiprolifératives des Analogues de Novobiocine Dérivés de Sucres Bien que les mimiques simplifiées de sucre aient été trouvées pour augmenter l’activité proliférante par rapport à DHN2 et à la novobiocine, des analogues plus simplifiés présentant une solubilité et une activité accrues étaient souhaités. Les N-hétérocycles sont présents dans divers composés biologiquement actifs et, contrairement aux glucides, ils sont généralement ionisés à un pH physiologique27. Après avoir examiné la première série d’études, nous avons proposé que l’appendice noviose joue un rôle important dans la solubilisation de la substance. noyau de coumarine hydrophobe et chaîne latérale de benzamide. Ainsi, les amines disponibles dans le commerce, 21 (Schéma 3, amines secondaires ont été protégées par Boc), ont été sélectionnées en tant que remplacements potentiels pour le groupement noviose. Ces alkylamines et analogues hétérocycliques contiennent une amine ionisable située à diverses positions au sein de la structure pour permettre des interactions potentielles de liaison hydrogène tout en augmentant simultanément la solubilité à travers leurs homologues ionisés.Structure 3Synthèse d’amines AnaloguesA l’origine, le couplage de ces amines avec le phénol 10 devrait permettre les produits désirés. Cependant, l’ester acétylique sur la chaîne latérale du benzamide a été hydrolyse dans ces conditions et a donné un mélange inséparable de produits mono- ou dialkylés. Pour contourner ce problème, l’aminé a d’abord été couplée avec l’anneau coumarine et ensuite avec la chaîne latérale benzamide pour donner les analogues désirés. La synthèse détaillée est décrite comme suit: on a fait réagir des amines tertiaires ou des amines secondaires masquées par Bocz avec de la coumarine 6 protégée en Cbz en présence de 2 équiv de triphénylphosphine et de diisopropylazodicarboxylate dans du tétrahydrofurane pour donner des coumarines dérivées d’aminé, 28a & gt; Le groupe protecteur Cbz a été éliminé par hydrogénolyse pour donner les amines libres, qui ont ensuite été couplées avec du chlorure d’acide 8 pour donner les composés 29a et 2222 avec un bon rendement. L’élimination du groupe protecteur Boc avec de l’acide trifluoroacétique dans du chlorure de méthylène a donné les analogues d’amine secondaire 30b, 30d et 30g. L’hydrolyse de l’ester phénolique avec de la triéthylamine méthanolique a donné des analogues, 31a et 2212 g, avec des rendements bons à excellents. L’activité antiproliférative manifestée par ces analogues a été évaluée par rapport aux lignées cellulaires SKBr3 et MCF-7. Comme le montre le tableau 2, les valeurs de CI50 pour les amines secondaires et tertiaires variaient entre 0,4 et 1,5 μ M, les rendant 1500 fois plus puissantes que la novobiocine.En général, la série d’esters présentait une activité antiproliférative comparable à celle de leurs contreparties phénoliques, ce qui suggère que les analogues d’esters peuvent rapidement s’hydrolyser dans les cellules en raison des estérases. En ce qui concerne les analogues de pipéridine, les analogues 4-substitués présentaient une plus grande activité que les analogues 3-substitués contre les deux lignées cellulaires. Par exemple, contre la lignée cellulaire SKBr3, le composé 29a est ∼ 3 fois plus actif que le composé 29c et les composés 30b et 31b sont 2 fois plus actifs que les composés 30d et 31d, respectivement. La même tendance a été observée pour les analogues non cycliques (29f contre 29e et 31f contre 31e). Ces résultats indiquent que la localisation de l’aminé est importante pour l’activité inhibitrice de liaison / manifestation. Une découverte surprenante de ce travail a été que les analogues contenant des amines non cycliques présentent des puissances équivalentes à leurs homologues de la pipéridine, spécifiquement, 29a et 29f et 31a et 31f, indiquant que l’inclusion d’un anneau contraint n’est pas nécessaire. Tableau 2 Activités antiprolifératives des analogues aminésPour confirmer que le remplacement du noviose par un sucre ou un substitut d’amino n’altère pas l’activité inhibitrice contre Hsp90, des analyses par transfert de Western de lysats cellulaires après l’administration de 18b ou 31b ont été effectuées. Comme le montrent la figure 2, les protéines client dépendantes de Hsp90, Her2, Raf et Akt, ont été dégradées dans les cellules MCF-7 d’une manière dépendant de la concentration lors du traitement avec 18b ou 31b. La protéine non-Hsp90-dépendante, l’actine, n’a pas été modifiée lors de l’administration de 18b ou 31b, ce qui indique que la dégradation sélective des protéines dépendant de Hsp90 a lieu en présence de 18b ou 31b. De plus, aucun de ces deux composés n’a induit la réponse au choc thermique, qui est une caractéristique partagée par les analogues de la novobiocine contenant du benzamide qui se lient à l’extrémité C-terminale Hsp90.28,29Figure 2Western analyses des protéines client Hsp90-depedent de poitrine MCF-7 lysats de cellules cancéreuses après traitement avec 18b (haut) ou 31b (bas). Les concentrations (en μ M) ont été indiquées au-dessus de chaque ligne, et la geldanamycine (G, 0.5 μ M) et le diméthyle … En conclusion, les imitations de sucre et les analogues aminés de l’appendice noviose sur l’anneau coumarine la novobiocine qui présente une solubilité et une activité antiproliférative améliorées ont été produites. Les substituts d’acides aminés cycliques et acycliques peuvent être synthétisés rapidement et permettront une identification rapide des analogues de la novobiocine qui peuvent fournir des possibilités cliniques pour le traitement du cancer. Le développement de composés améliorés qui présentent une telle activité est en cours, et les résultats de ces études seront rapportés en temps voulu.