Détection de plusieurs espèces de protéines réactives par immunoblotting après la vaccination contre la maladie de Lyme contre la protéine de surface externe recombinante

La confirmation en laboratoire du diagnostic de la maladie de Lyme est basée sur la détection d’une réponse immunitaire à Borrelia burgdorferi. Le sérodiagnostic de l’infection à B burgdorferi est complexe et peut être davantage confondu avec la réponse immunitaire à la protéine recombinante de la surface externe silagracipla.net. comment la réponse sérologique au vaccin contre la maladie de Lyme recombinante affecte le dépistage de l’anticorps anti-B burgdorferi, des échantillons provenant des sujets de l’étude ont été obtenus à intervalles définis après vaccination contre la maladie de Lyme recombinante OspA Lyme, immuno-enzymatique EIA, et Western blotting WB Après la vaccination recombinante contre la maladie de Lyme OspA, ELISA pour% des sujets de l’étude a révélé une réactivité WB avec l’utilisation de souches de B burgdorferi contenant OspA comme sources d’antigènes démontrées plusieurs bandes Résultats des tests avec une US Food and Drug Administration- Le kit WB approuvé a montré une réactivité homogène dans la région du poids moléculaire & gt; Des tests kDa avec des souches sans OspA ont complètement éliminé toute la réactivité associée au vaccin à la fois par la capture d’anticorps EIA et WB

La maladie de Lyme est une maladie inflammatoire multisystémique causée par une infection à Borrelia burgdorferi C’est la maladie infectieuse vectorielle la plus répandue aux États-Unis. Le diagnostic de la maladie de Lyme dépend d’une combinaison de caractéristiques cliniques et de la démonstration de B burgdorferi. Récemment, des vaccins recombinants à base de protéine A OspA de surface externe ont été proposés comme une intervention potentielle pour aider à contrôler l’épidémie de la maladie de Lyme Résultats des grands essais cliniques de phase III ont été récemment rapportés, démontrant leur innocuité et leur efficacité ; L’approbation finale pour la libération de ces vaccins a été obtenue en décembre. Bien que de nombreux problèmes entourant l’utilisation future du vaccin ne soient pas résolus, ce vaccin devrait être largement utilisé dans les régions où la maladie de Lyme est endémique. Cette circonstance a conduit à la suggestion que le Western blotting WB pourrait être le test préféré pour évaluer l’infection possible de B burgdorferi chez les sujets de l’étude qui ont reçu la maladie recombinante de OspA Lyme. vaccin Nous fournissons une description détaillée du profil sérologique après la vaccination recombinante contre la maladie de Lyme OspA; plusieurs méthodologies de test, y compris WB ont été utilisés dans cette analyse

Sujets et méthodes

Les sujets de l’étude étaient en bonne santé au départ et se sont portés volontaires pour participer aux essais pivots de phase III du vaccin recombinant contre la maladie de Lyme OspA Aucun de nos sujets étudiés n’avait d’antécédents de maladie de Lyme Un total de spécimens provenant des sujets de l’étude ont été collectés Les échantillons des sujets de l’étude ont été collectés au départ et quelques jours après la troisième dose. SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, Belgique Des échantillons provenant d’autres sujets de l’étude ont été prélevés au départ, plusieurs jours après la dose, plusieurs mois après la dose et plusieurs mois après la dose. Un kit ELISA approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) EIA pour la détection d’anticorps IgG et IgM contre B burgdorferi; MarDx, Carlsbad, CA et un kit WB MarBlot approuvé par la FDA pour la détection d’anticorps IgG contre B burgdorferi; Les tests sérologiques ont été effectués selon les recommandations du fabricant. Les EIA de capture d’anticorps ont été réalisés et les résultats des tests ont été interprétés selon les méthodes précédemment rapportées , et des isotypes IgM, IgG et IgA spécifiques ont été utilisés. [B] Les réactifs de test utilisés comprenaient des souches standard de B burgdorferi natives. On a également effectué le WB interne comme décrit ailleurs . Brièvement, la souche G / B de burgdorferi a été transférée sur des bandes de nitrocellulose à une concentration finale de ng antigène. les bandes ont été incubées ° C pour h avec -mL volumes de sérums de patients dilués: dans du PBS pH contenant% de polysorbate et% de lait écrémé sec Les anticorps IgG patients liés aux protéines B burgdorferi ont été détectés avec le substrat -bromo-chloro-indolyl phosphate nitroblue tétrazolium Sigma, St Louis après incubation ° C pour h avec anticorps de chèvre conjugué à la phosphatase alcaline à l’IgG humaine:; Biosource International, Camarillo, CA Une EIA de capture d’anticorps et une WB interne ont également été réalisées; souches B burgdorferi génétiquement différentes qui n’ont pas le gène pour l’expression OspA ont été utilisés dans ces tests

Résultats

Capture d’anticorps EIA Un total de spécimens ont été testés par capture d’anticorps EIA Les échantillons de tous les sujets de l’étude étaient négatifs au départ Les sujets de l’étude à partir desquels un échantillon a été obtenu plusieurs jours après la dose du vaccin OspA Lyme recombinant,% étaient séroréactifs avec ≥ isotypes Ig % étaient séro-réactifs avec les IgM,% étaient séro-réactifs avec les IgG, et% étaient séro-réactifs avec les IgAS. Les patients restants ont été prélevés sur les sujets restants quelques jours après la dose,% étaient séro-réactifs avec IgM,% séroréactifs avec IgG et% séroréactifs. En mois après la dose,% de ces sujets restaient séro-réactifs avec les IgG,% étaient séroréactifs avec les IgA et aucun n’était séroréactif avec les IgM. Plusieurs mois après la dose,% de ces sujets restaient séroréactifs avec les IgG et aucun n’était séroréactif avec les IgA. et IgM Deux ans après la dose, seules les IgG étaient détectables chez les sujets d’étude% Lorsque les groupes de sujets de l’étude ont été évalués Les réponses IgM et IgA ont été les plus fréquemment observées après la dose, et la réponse à tous les isotypes a diminué au cours du temps. Kit ELISA pour la détection des IgM et des IgG. Séropositivité a été observée en% des échantillons obtenus après dose du vaccin contre la maladie de Lyme OspA recombinant Dans des% des cas, les valeurs ont été trouvées supérieures à celles du sujet témoin hautement positif pour ELISA. Le sujet témoin fortement positif avait une valeur de ~ unités d’indice; le sujet témoin faiblement positif avait une valeur d’unités d’index Les échantillons provenant des sujets vaccinés avaient une absorbance moyenne significativement supérieure à celle du témoin positif élevé Résultats pour des échantillons représentatifs de répondeurs faibles, modérés et forts identifiés par le test WB au départ, jours après la dose, mois après la dose et années après la dose sont également indiqués dans le tableau Bien que les nombres soient faibles, le pourcentage de résultats ELISA positifs était le plus élevé jours après la dose. sélectionnés pour représenter les réponses faibles, moyennes et fortes Des échantillons étaient disponibles chez chaque sujet au départ, jours après la dose et mois après la dose. En outre, les sujets d’étude à partir desquels les échantillons ont été prélevés au départ et après la dose ont été testés. sujets patients, le chiffre était positif au départ et non le même sujet qui était positif par ELISA Après la vaccination, plusieurs Des bandes ou des régions de réactivité sérologique ont été observées dans des régions de bas poids moléculaire ≤ kDa-bandes qui n’étaient pas présentes au départ. De plus, une région homogène indistincte de réactivité blot au dessus de la région de poids moléculaire de kDa a été observée. de réactivité plusieurs jours après la dose, et les deux bandes multiples dans les régions de masse moléculaire inférieure et la réactivité homogène au-dessus de la région du poids moléculaire de kDa continuée et mois après la dose en% des spécimens Figure WB interne avec souches B burgdorferi natives Lorsque les mêmes spécimens Le plus remarquable était l’absence de réponse non spécifique homogène de haut poids moléculaire après la vaccination. Néanmoins, pour de nombreux spécimens, de multiples bandes de réactivité distinctes ont été observées. pas présent à la ligne de base Bandes caractéristiques de r La réactivité incluait celles des poids moléculaires du% des échantillons,%,%,%,%,%,%,% et% kDa. La réactivité aux bandes -, -, -, – et-kDa a été notée dans certains cas. l’Association des directeurs de laboratoires de santé publique des états / territoires pour la prévention et le contrôle des maladies Critères CDC pour une BB positive confirmant le diagnostic d’infection à B burgdorferi EIA et WB de capture d’anticorps avec utilisation de souches de B burgdorferi sans OspA Les échantillons ont été testés par EIA de capture d’anticorps, avec l’utilisation des souches nouvellement décrites de B burgdorferi dépourvu d’expression native OspA comme réactifs de test, tous étaient négatifs Ces mêmes échantillons étaient% positifs par ELISA commercial et% positifs par capture d’anticorps EIA Quand les mêmes spécimens ont été testés par WB avec l’utilisation de souches de B burgdorferi exemptes d’OspA, toute la réactivité associée au vaccin a été éliminée, spécifiquement toutes les bandes multiples identifiées par WB suite à l’administration du recombinant. OspA vaccin contre la maladie de Lyme WB réactivité qui n’a pas été révélée avant la vaccination n’a pas été démontrée par des tests avec des réactifs sans OspA

Discussion

rete bandes à poids moléculaire & gt; kDa est souvent peu fiable ou impossible en raison de la coloration homogène dans ce domaine, compromettant la capacité de ce test à diagnostiquer la maladie de Lyme chez les sujets vaccinés Le fabricant du seul vaccin recombinant OspA Lyme actuellement approuvé et approuvé par la FDA suggère que la vaccination n’interfère pas avec l’évaluation sérologique de la maladie de Lyme chez les sujets vaccinés – une affirmation qui n’est pas étayée par les données présentées iciLa troisième conclusion importante est que les immunodosages basés sur des variantes génétiques de B burgdorferi, qui manquent du gène codant OspA, existent et peuvent être utilisés pour résoudre les problèmes associés à la réponse vaccinale Si un test réactif, positif, est démontré par ELISA ou EIA classique et que toute la réactivité disparaît quand il y a un nouveau test avec des réactifs sans OspA, c’est-à-dire devient « négatif », on peut alors conclure que le test «positif» initial est le reflet de la vaccination recombinante contre la maladie de Lyme OspA et non de Si la réactivité ELISA ou EIA persiste après un test avec des réactifs sans OspA, c’est-à-dire reste «positive», elle peut refléter une infection vraie par B burgdorferi De même, si plusieurs bandes démontrées par immunoblot conventionnel disparaissent lorsque le sérum est testé par un Immunoblot avec des réactifs sans OspA, on peut alors conclure que les bandes observées étaient causées par une réponse immunitaire de l’hôte au vaccin OspA Lyme recombinant et non par B burgdorferi. La persistance de plusieurs bandes révélées par immunoblot avec utilisation de réactifs sans OspA suggère que la réactivité représente une infection réelle Cependant, pour justifier le remplacement complet des antigènes actuellement utilisés avec des réactifs OspA-négatifs, des études supplémentaires seront nécessaires pour démontrer une sensibilité équivalente à celle des tests actuels. Essais de sérum de sujets d’étude supplémentaires obtenus plusieurs jours après la dose. vaccin contre la maladie de Lyme OspA recombinant Pasteur Meriéux Connaught, Swiftwater, PA ont été testés par les mêmes données méthodologiques non montrées Des résultats similaires de bandes multiples après vaccination ont été observés lorsque des tests avec utilisation de souches conventionnelles contenant OspA ont été effectuées, mais pas lorsque des tests avec utilisation de souches sans OspA ont été effectuées. La vaccination recombinante purifiée contre la maladie de Lyme OspA Lyme résulte de l’observation de multiples bandes sur les immunoblots. Une explication possible est qu’il existe une homologie de séquence entre l’OspA recombinant et d’autres antigènes de Borrelia, comme la protéine B de surface externe dont peut être codé par le même plasmide Une autre possibilité peut être que la préparation de bandelettes immunoblot en laboratoire peut entraîner la dégradation de l’OspA recombinant en fragments plus petits représentant une partie de la réactivité de masse moléculaire inférieure et en dimères ou trimères représentant une partie de la réactivité moléculaire Il est en outre possible qu’il y ait quelques b induite ou association entre OspA ou ses fragments et des protéines B de burgdorferi de masse moléculaire plus élevée, expliquant une partie de la réactivité observée dans cette région. Une implication intéressante de la découverte de ces bandes multiples spécifiques après vaccination par OspA Lyme recombinante est la réactivité les poids proposés par les CDC pour inclusion dans les critères pour des «bandes» de confirmation et de diagnostic spécifiques peuvent représenter une réponse immunitaire à OspA Il est possible que la réactivité à OspA soit «comptée» plusieurs fois Par exemple, la réactivité aux poids moléculaires de,, et kDa peuvent tous être des «bandes OspA», bien qu’il soit reconnu que les réponses immunitaires à d’autres protéines B burgdorferi peuvent également entraîner une réactivité dans certaines de ces mêmes régions. La réactivité observée dans la région -kDa peut être une protéine -kDa B burgdorferi ou un antigène ou à un épitope OspA provoquant une réactivité à kDa, comme l’ont montré ces résultats post-vaccinaux. En résumé, ELISA et EI A pour la détection d’anticorps contre B burgdorferi sont positifs par des critères standard pour les receveurs du vaccin contre la maladie de Lyme recombinant OspA Lyme Quand WB des échantillons sériques des receveurs du vaccin recombinant OspA Lyme maladie est réalisée avec l’utilisation de B standard burgdorferi Ces bandes multiples peuvent potentiellement fausser l’interprétation des résultats des tests sérologiques pour les sujets de l’étude vaccinés contrairement aux déclarations faites dans la notice du fabricant du vaccin. Les deux types de séroréactivité sont éliminés si les souches sans OSPA sont utilisés comme réactifs de test Ces résultats sont d’une importance capitale dans l’interprétation des résultats des tests de dépistage de la maladie de Lyme dans les populations vaccinées. Cette découverte sérologique deviendra un problème majeur à mesure que ces vaccins seront largement utilisés. de l’infection B burgdorferi est en cours

Remerciements

Nous remercions et apprécions l’assistance technique de Valerie Halling, Kristen Hennessy et Karen Weeks ainsi que l’assistance administrative de Kimberly Beasley