Un tropheryma whipplei de Western Paradoxal différencie les patients atteints de la maladie de Whipple des porteurs asymptomatiques

Contexte Tropheryma whipplei est une bactérie responsable de la maladie de Whipple Cependant, T whipplei peut être transporté dans l’intestin de personnes asymptomatiques, ce qui peut rendre difficile l’interprétation des résultats positifs des tests de dépistage des selles. Méthodologie Cette étude incluait des patients atteints de la maladie de Whipple classique. Un test à l’aveugle impliquant des patients et des porteurs a été réalisé Des échantillons de sérum provenant de patients traités ont été testés pour des immunoglobulines totalesRésultats Immunoglobuline totale provenant de patients avec la maladie de Whipple classique présentait soit un manque de réaction [%] des patients ou une diminution de la réaction [%] des patients avec une glycoprotéine T whipplei de kDa après déglycosylation Seuls les patients présentaient une réponse immunitaire plus forte que celle observée pour les porteurs [% ] des transporteurs Cinq transporteurs ont présenté un profil de réponse similaire à celle pour les patients IgM [%] des patients ou IgA [%] des patients réponses étaient rarement observées mais étaient exclusives aux patients Globalement, les résultats étaient cohérents et reproductibles L’antibiothérapie n’a eu aucun effet sur les profils sérologiques des patientsConclusions Western blot sérologie est utile pour distinguer les porteurs et les patients; réponses paradoxales des anticorps ont été étudiés

La culture récente de Tropheryma whipplei, agent de la maladie de Whipple, a permis de nouvelles perspectives pour l’étude de la maladie et de la bactérie En effet, la forme bien connue et classique de la maladie de Whipple se caractérise par des les bacilles dans les macrophages infectés de l’intestin grêle ne représentent qu’une forme clinique rare d’infection qui peut être causée par T. whipplei La bactérie est également capable de provoquer des infections localisées, telles que l’endocardite et la méningo-encéphalite. Le diagnostic précoce de la maladie de Whipple classique est essentiel, car la maladie est potentiellement responsable de séquelles et peut être fatale si elle n’est pas traitée. Cependant, la maladie de Whipple classique est toujours présente. Le développement d’une méthode de culture fiable pour la croissance in vitro de T. whipplei a permis de développer un Cependant, plusieurs tentatives pour développer une telle méthode ont échoué. Les antigènes bruts utilisés dans les tests d’immunofluorescence indirecte se sont avérés utiles pour la détection d’immunoglobulines Ig M spécifiques, mais la spécificité était perdue en quelques mois De plus, il y avait une association paradoxale de la maladie de Whipple avec une réponse immunologique plus faible chez les patients comparés aux porteurs asymptomatiques Un changement antigénique des bactéries, très probablement lié au processus de glycosylation, perte de spécificité Un dosage immuno-enzymatique ciblant une partie du gène hsp n’était pas précis ou fiable pour distinguer les patients des sujets témoins Une analyse immunoprotéomique globale du protéome de whipplei T sur la base d’une électrophorèse La spectrométrie et l’analyse immunoblot ont identifié des protéines antigéniques candidates putatives Un ensemble de protéines Les chercheurs ont également analysé les protéines basiques de Whipplei pour améliorer la détection des antigènes bactériens immunodominants putatifs. Un sucre a été utilisé pour diagnostiquer avec succès tous les patients étudiés, mais la spécificité élevée requise pour le diagnostic pratique n’a pas été démontrée. Le transporteur ABC TWT était le meilleur marqueur pour le développement de tests sérodiagnostiques pour la maladie de Whipple classique, mais la sensibilité de ce marqueur était seulement de%, et la spécificité était de%. Par conséquent, aucune tentative de proposer un diagnostic sérologique applicable n’a été réussie. des données préliminaires récentes , qui suggèrent que la reconnaissance immunitaire médiée par les anticorps est altérée chez les patients atteints de la maladie de Whipple classique par rapport aux porteurs asymptomatiques de T. whipplei, nous avons développé et validé une nouvelle méthode pour distinguer ces populations

Patients, matériaux et méthodes

Sujets d’étude

Recrutement de la population L’étude a inclus des patients français et italiens atteints de la maladie de Whipple classique hommes et femmes; tranche d’âge, – années; âge moyen ± déviation standard [SD], ± années et porteurs asymptomatiques de French whipplei hommes et femmes; tranche d’âge, – années; Âge moyen ± SD, ± ans Parmi les porteurs asymptomatiques, les égoutiers et les patients avec un diagnostic excluant la maladie de Whipple ont été inclus Tous les patients et porteurs asymptomatiques ont reçu un diagnostic dans notre laboratoire de Marseille, France, qui est un centre de référence pour le diagnostic de Maladie de Whipple dans notre pays Les échantillons des patients et des porteurs asymptomatiques ont été envoyés à notre laboratoire à des fins diagnostiques , tandis que les échantillons des égoutiers ont été envoyés à notre laboratoire pour des études épidémiologiques Maladie de Whipple et définition du transport symptomatique pour confirmer un diagnostic définitif de la maladie de Whipple classique comprenait la présence de résultats positifs par coloration périodique acide-Schiff et / ou immunohistochimie spécifique d’un échantillon de biopsie de l’intestin grêle Nos critères pour établir le statut des porteurs asymptomatiques de T whipplei absence de résultats positifs par coloration périodique à l’acide de Schiff et / ou immunisation spécifique Pour les travailleurs des égouts, les critères permettant d’établir le statut des porteurs asymptomatiques étaient l’absence de manifestations cliniques et la présence de l’ADN de T whipplei dans les échantillons de selles . L’étude a été approuvée par le comité local d’éthique ref Phase de dépistage Au moment du diagnostic de la maladie de Whipple, le sérum était disponible chez les patients. Sérum était également disponible pour les porteurs asymptomatiques T whipplei Phase de confirmation Quelques mois après le diagnostic, les sérums ont été Vérification de la cohérence des résultats Les sérums ont été rééchantillonnés pour les porteurs asymptomatiques, y compris les égoutiers et les patients sans maladie de Whipple. Un test à l’aveugle, comprenant des échantillons sériques de patients atteints de la maladie de Whipple et de porteurs asymptomatiques, a été effectué pour vérifier la reproductibilité des résultats. échantillons de patients atteints de la maladie de Whipple, qui étaient échantillonné au moins plusieurs mois après l’instauration d’un traitement adéquat pour la maladie de Whipple, en mois; durée moyenne ± ET, ± mois, ont également été testés avec Western blot pour étudier l’effet des traitements antibiotiques sur la réponse de l’immunoglobuline totale

Analyses par Western Blot

Dosages de transfert Western Les dosages sérologiques ont été réalisés par Western Blot. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium SDS-PAGE et transférées sur des membranes de nitrocellulose. La souche Twist de T. whipplei a été cultivée en milieu axénique. les échantillons ont été déterminés à l’aide d’un réactif Bio-Rad Hercules Des échantillons natifs et déglyclosylés obtenus à partir de l’extrait bactérien total ont été préparés pour SDS-PAGE Pour la déglycosylation, μL de protéines T whipplei Twist concentrées à μg / μL ont été dénaturées avec une solution dénaturante octyl β-D -glucopyranoside% et mmol / L-mercaptoéthanol; La suspension a ensuite été incubée pendant h à ° C avec les glycosidases suivantes: pL de N-glycosidase F recombinante F PNGase F, U / mL de Flavobacterium meningosepticum Roche Diagnostics, pL d’endoglycosidase H PNGase H, U / ml de Streptomyces plicatus Sigma-Aldrich Chimie, et μL de α → ,,, sialidase U / mL d’exoglycosidase recombinante d’Arthrobacter ureafaciens Sigma-Aldrich Chimie Les cellules Twist T whipplei natives et déglyclosylées ont été remises en suspension dans un tampon Laemmli Sigma-Aldrich Chimie contenant mmol / L dithiothréitol pour obtenir une concentration finale en protéine de μg / μL et ont été chauffés pendant min à ° C Pour chaque échantillon, μg de protéine ont été chargés dans chaque puits et ont été résolus en utilisant SDS-PAGE%. -mot de transfert de transfert, membrane de nitrocellulose pure, mm; Bio-Rad pour une période de -h avec utilisation d’une unité de transfert semi-sèche Hoeffer TE, GE Healthcare Les membranes ont été immergées dans une solution saline tamponnée au phosphate additionnée de% Tween et% de tampon de blocage du lait écrémé pour h à température ambiante avant Les membranes ont ensuite été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et du Tween, et des spots immunoréactifs ont été détectés par incubation de membranes à température ambiante avec un anticorps anti-humain de chèvre conjugué à la peroxydase. Southern Biotech, qui a été dilué: dans le tampon de blocage Le test a été réalisé pour tester un pool d’IgG, IgM et IgA immunoglobulines totaux chaînes lourdes et légères, ainsi que IgG, IgM et IgA séparément Southern Biotech Detection a été réalisée en utilisant chimiluminescence ECL Western Blot Système d’analyse et un processeur de film automatisé Hyperprocesseur; GE HealthcareWestern interprétation de l’empreinte Pour quantifier les bandes sur Western blots, les films ont été scannés avec Image Scanner III GE Healthcare analyse de l’image a été réalisée avec GelEval b FrogDance logiciel et ImageJ v logiciel Wayne Rasband National Institutes of Health paramètres ont été mesurés dans les régions d’intérêt pour quantifier le signal diminution de la bande GpTw après déglycosylation, nous avons utilisé le rapport des densités moyennes gpTw / Δgly GpTw, où gly GpTw est la densité de la bande GpTw moins fond et Δgly GpTw est la densité de la bande GpTw déglycosylée moins les images de fond Blot ont été analysées en utilisant ImageMaster D Platinum, version GE Healthcare, comme décrit ailleurs Lors de notre étude préliminaire, l’analyse de l’intensité du signal GpTw après déglycosylation a montré une diminution importante et significative des sérums des patients mais pas des porteurs . établir un test de diagnostic Par conséquent, dans cette étude, le transport asymptomatique de T whipplei a été La détection de la maladie de Whipple classique a été définie comme étant la diminution de l’intensité du signal de GpTw après déglycosylation, ou comme si une absence de réponse d’anticorps était observée à la fois contre la déglycosylation et contre la déglycosylation. T whipplei natif et déglyclosulé, tel que rapporté ailleurs

Analyses statistiques

L’analyse statistique a été effectuée par le test exact de Fisher avec l’utilisation de EpiInfo http: // wwwcdcgov / epiinfo / Epi / EIdnjphtmA une expression différentielle a été considérée comme statistiquement significative lorsque P & lt; La valeur prédictive positive a été définie comme la proportion de résultats vrais-positifs parmi les résultats vrais-positifs et faussement-positifs. La valeur prédictive négative a été définie comme la proportion de résultats vrais-négatifs parmi les résultats vrais-négatifs et faussement-négatifs

Résultats

Phase de dépistage Les échantillons de sérum des porteurs de T whipplei présentaient une réponse immunitaire nettement meilleure que ceux des patients atteints de la maladie de Whipple classique. Les immunoglobulines des échantillons de sérum des patients atteints de la maladie de Whipple présentaient soit un manque de réponse immunitaire, soit une diminution de la réponse. après le tableau de déglycosylation Lors du dépistage de l’immunoglobuline totale,% des patients atteints de la maladie de Whipple classique présentaient un profil de transfert de Western compatible avec l’infection, alors que seulement% des porteurs présentaient un profil compatible avec l’infection P & lt; figure

Diapositives de Western Blot WB avec des antigènes de Tropheryma Whipplei natifs et Deglyclosylated pour les IgG, IgG, IgM et IgA d’immunoglobulines totales provenant de premier et second échantillons de sérum provenant de patients atteints de maladie Whipple classique et de transporteurs asymptomatiques avec T whipplei dans des échantillons de sellesTable View largeTélécharger Résultats des tests de Western Blot WB avec des antigènes de Tropheryma Whipplei natifs et Deglyclosylated pour les immunoglobulines totales IgG, IgG, IgM et IgA provenant de premier et second échantillons de sérum provenant de patients atteints de la maladie de Whipple classique et de transporteurs asymptomatiques avec T whipplei dans des échantillons de selles

Les antigènes deglyclosylated de Whipplei ont été testés Dans la première rangée, les modèles de réaction des patients avec la maladie de Whipple classique WD sont montrés, et dans la deuxième rangée, les modèles de réaction des transporteurs sont montrés Le nombre et le pourcentage de réactions positives est donné pour chaque catégorieParmi les patients Les résultats obtenus avec l’IgG étaient presque identiques à ceux obtenus avec l’immunoglobuline totale. Seuls les patients atteints de la maladie de Whipple présentaient une réponse à l’IgM et le patient présentait une réponse à l’IgM. réponse avec IgA La diminution de l’intensité du signal a été observée non seulement pour l’immunoglobuline totale mais aussi pour d’autres immunoglobulines Aucun des porteurs n’a présenté de réponse IgM ou IgA Parmi les porteurs présentant un profil compatible avec l’infection, il y avait une réponse diminuée dans l’intensité du signal de GpTw après déglycosylation Si ce dépistage est analysé en considérant une réponse immunitaire négative, la valeur prédictive positive pour le diagnostic de la maladie de Whipple classique est% pour les immunoglobulines totales et IgG,% pour IgM et% pour IgA Si une réponse immunitaire positive est considérée à l’intensité du signal après déglycosylation, la valeur prédictive négative est% pour l’immunoglobuline totale et IgG et% pour IgM et IgA Lorsque la diminution de l’intensité du signal de la réponse immunitaire après déglycolysation est considérée, la valeur prédictive positive pour le diagnostic de la maladie de Whipple classique est% Si l’on considère une réponse immunitaire négative ou une diminution de l’intensité du signal de la réponse immunitaire après déglycosylation, la valeur prédictive positive est% pour l’immunoglobuline totale et IgG et% pour IgM et IgA dépistage de l’immunoglobuline totale présente dans le deuxième groupe d’échantillons de sérum, chez des patients atteints de la maladie de Whipple ont montré un profil de transfert de Western compatible avec l’infection, alors que seulement des porteurs présentaient un profil compatible avec l’infection P & lt; Dans l’ensemble, les données sont très cohérentes Parmi les patients atteints de la maladie de Whipple classique, l’absence de réponse immunitaire et l’intensité du signal GpTw diminuée après déglycosylation ont été observées. Les mêmes résultats ont été observés pour les IgG. Les patients atteints de la maladie de Whipple classique ont présenté une réponse avec IgA Aucun des porteurs n’a présenté de réponse IgM ou IgA Parmi les patients atteints de la maladie de Whipple classique présentant un profil de transfert de Western compatible avec le portage, un échantillon de sérum supplémentaire était disponible , qui a confirmé les résultats obtenus avec le premier échantillon de sérum Ce patient était un homme âgé de treize ans souffrant d’arthralgies et de diarrhée et ayant reçu un diagnostic de maladie de Whipple; ce diagnostic était basé sur une coloration positive périodique à l’acide de Schiff et une immunochimie spécifique sur les biopsies duodénales et synoviales ainsi qu’une immunochimie positive sur les monocytes sanguins Le patient a été perdu de vue chez les égoutiers avec un profil Western blot compatible avec l’infection Une même conclusion a été obtenue avec les deux échantillons par Western Blot Assay. Cependant, aucune réponse d’anticorps n’a été observée avec le premier échantillon de sérum, alors qu’une légère réponse a été observée dans le second échantillon de sérum, avec une différence L’intensité du signal de GpTw après déglycosylation Deux égouts qui étaient considérés comme des porteurs asymptomatiques lors du premier dépistage présentaient un profil compatible avec l’infection lors du second dépistage, avec une différence dans l’intensité du signal de GpTw après déglycosylation. avec la maladie de Whipple et les porteurs asymptomatiques, ont corroboré les données obtai La phase de suivi Parmi les patients atteints de la maladie de Whipple, qui présentaient un échantillon de sérum après le début de l’antibiothérapie, l’absence de réponse a diminué et l’intensité du signal a diminué après la déglycosylation lors du premier dépistage. Les patients présentant une diminution de l’intensité du signal après la déglycosylation au cours de la thérapie antibiotique, présentaient toujours une diminution de l’intensité du signal après la déglycosylation. Le traitement antibiotique n’a eu aucun effet sur les profils de Western blot Enfin, l’analyse de suivi du transport de T whipplei dans les échantillons de selles pour les porteurs asymptomatiques est résumée dans le tableau Aucune corrélation n’a été observée entre la longueur du le profil observé obtenu par Wester n blot

Diapositives de Western Blot Assay pour les transporteurs asymptomatiques et analyse de suivi de Tropheryma Whipplei Carriage dans des échantillons de sellesTable View largeTélécharger Diapositives de Western Blot Assays pour les transporteurs asymptomatiques et analyse de suivi de Tropheryma Whipplei transport dans des échantillons de selles

Discussion

Les sujets, y compris les patients et les porteurs asymptomatiques, présentaient le même profil pour les échantillons sériques obtenus à différents moments, et le test aveugle confirmait les données précédemment obtenues. Nous pouvons exclure la possibilité que les différentes réactions sérologiques ne reflètent pas la diversité génotypique des souches T whipplei, parce qu’il a été démontré que cette diversité n’était pas liée à la pathogénicité bactérienne, et dans cette étude, certains patients atteints de la maladie de Whipple classique ont été infectés par le même génotype qui a été retrouvé dans les selles des porteurs asymptomatiques. Le test sérologique de Whipplei Western Blot, basé sur l’analyse de GpTw avant et après la déglycosylation, est un outil efficace pour déterminer la différence entre les patients atteints de la maladie de Whipple classique et les porteurs de Whipplei T. Les preuves accumulées suggèrent que T whipplei est un microorganisme commun dans l’environnement. ,,] Selon l’étude, autant que% des égouts sont asymptom Cependant, la fréquence de la maladie de Whipple détectée dans les échantillons de selles a entraîné des difficultés à interpréter les échantillons positifs de selles, tels que déterminés par la polymérase achetez des comprimés. En outre, des preuves de séroconversion après une infection primaire ont été récemment démontrées chez des enfants avec des données non publiées de l’auteur de la diarrhée. Sur la base de ce test sérologique, les patients atteints de la maladie de Whipple classique peuvent être divisés en populations: T whipplei et individus présentant une différence de réaction aux protéines glycosylées et déglycosylées La présence d’IgM et / ou d’IgA est rare mais est observée exclusivement chez les patients atteints de la maladie de Whipple classique, comme démontré ailleurs Les IgG sont les plus fréquemment détectées, détection d’IgG est parallèle à la détection totale des immunoglobulines. Récemment, nous avons proposé une stratégie pour diagnostiquer la maladie de Whipple classique qui était basée sur le dépistage de la salive et des échantillons de selles avec l’utilisation de la PCR quantitative en temps réel spécifique [ ] En effet, le diagnostic présomptif de la maladie de Whipple classique devrait être fortement suspecté chez les patients ayant à la fois des échantillons de salive et de selles positifs pour T whipplei, déterminés par PCR quantitative, avec une valeur prédictive positive de%. suivi de la PCR quantitative pour T whipplei dans les échantillons sanguins Cependant, la sensibilité de la PCR sur les échantillons sanguins était faible [%] pour la maladie de Whipple classique Par conséquent, une sérologie Western blot devrait être réalisée pour compléter les résultats quantitatifs positifs dans les selles et / ou des échantillons de salive pour le diagnostic de la maladie de Whipple classique En outre, une sc En effet, l’absence de contact préalable avec la bactérie affectera l’interprétation des données. Cette méthodologie n’est pas un outil de diagnostic pour les patients avec des résultats de PCR négatifs mais doit être réservée aux patients. avec des résultats de PCR positifs des échantillons de salive et / ou de selles Enfin, ces résultats indiquent également l’importance des différentes réponses immunitaires entre les patients atteints de la maladie de Whipple classique et les porteurs asymptomatiques. La réactivité immunitaire est faible chez les patients atteints de la maladie de Whipple classique. La réactivité est encore faible même lorsque les patients atteints de la maladie de Whipple reçoivent une antibiothérapie adéquate Cette réponse paradoxale peut être la conséquence d’un déficit immunitaire macrophagique et d’une élimination inefficace chez les patients Récemment, l’importance de la glycosylation des protéines Whipplei dans la pathogenèse de Whipple la maladie a été Cette étude a confirmé à grande échelle que les anticorps des patients atteints de la maladie de Whipple reconnaissent principalement la forme glycoconjuguée, mais pas la forme native de la protéine, contrairement aux porteurs asymptomatiques. Ainsi, la glycosylation de Whipplei peut altérer la reconnaissance immunitaire chez les patients et servir de mécanisme protecteur pour T whipplei de l’activité bactéricide des macrophages Un tel système de masquage intracellulaire n’a pas été précédemment décrit chez les bactéries, à notre connaissance. Notre étude a clairement démontré que la réponse immunitaire humorale classique des porteurs de T whipplei était significativement plus élevée. ceux des patients atteints de la maladie de Whipple classique Paradoxalement, l’absence de réponse immunitaire faible et / ou faible observée avec le test Western blot T whipplei est l’outil actuel pour différencier les patients atteints de la maladie de Whipple classique des transporteurs de Whipplei. dans la population générale sera très intéressant

Remerciements

Nous remercions Isabelle Combe pour son aide. Soutien financier Programme du ministère de la Santé Hospitalier de Recherche Clinique Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits