Nstylée sst2 Analogue peptidique cyclique de la somatostatine sélective en tant que candidat potentiel pour le traitement de l’inflammation neurogène

L’inflammation neurogène désigne la vasodilatation et l’extravasation des protéines plasmatiques ( formation d’œdème) induite par des neuropeptides sensoriels pro-inflammatoires tels que le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) et la substance P (SP) libérée par les activa Ces processus sont suivis par l’activation des cellules inflammatoires plus tard. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens classiques ne peuvent pas inhiber la composante neurogène, qui joue un rôle important dans les mécanismes pathologiques de plusieurs maladies inflammatoires, par exemple la polyarthrite rhumatoïde, la dermatite allergique de contact, le psoriasis, l’asthme et les maladies inflammatoires intestinales. Les corticostéroïdes ne sont efficaces qu’à très forte dose et produisent des effets secondaires graves2. La SP et la CGRP sont également impliquées dans la douleur neuropathique, plutôt résistante aux analgésiques conventionnels. Par conséquent, des agents agissant au niveau des terminaisons nerveuses sensorielles elles-mêmes pour inhiber la libération de ces neuropeptides sensoriels pro-inflammatoires / pro-nociceptifs sont désirés pour le développement d’un nouveau groupe de médicaments anti-inflammatoires et analgésiques.La somatostatine (SST), un neuropeptide naturel, induit généralement une activité inhibitrice dans le système nerveux central et agit comme un neurotransmetteur affectant l’activité locomotrice et la fonction cognitive.3 Dans le système nerveux périphérique, elle se trouve dans les neurones sensoriels et sympathiques où elle exerce la régulation à la baisse de la nociception et des composants neurogéniques des processus inflammatoires.4,5 SST contrecarre les effets de SP dans l’inflammation neurogène due à l’inhibition de la libération de neuropeptide pro-inflammatoire ou des actions des récepteurs opposés. SST agissant sur ses propres récepteurs inhibe les actions SP médiée par le récepteur de la neurokinine 1 (NK1) sur la vasodilatation dans les artérioles, ainsi que sur l’extravasation des protéines plasmatiques des veinules postcapillaires, l’accumulation et la production de cytokines des cellules immunitaires et autres cellules inflammatoires stimulées. neurotropes sensoriels pro-inflammatoires libérés, SST est également libérée par les terminaisons périphériques de la population peptidergique sensible à la capsaïcine des neurones sensoriels primaires en réponse à l’activation.4 − 7 Elle pénètre dans la circulation systémique et inhibe les processus inflammatoires et nociceptifs chez le rat et les modèles expérimentaux murins probablement via les sous-types de récepteurs SST 1 et / ou 4 (sst1 / sst4; groupe récepteur SRIF1), tandis que l’inhibition de la sécrétion hormonale est médiée par les sous-types sst2, sst3 et sst5 (groupe récepteur SRIF2) .SST, en raison de sa large gamme d’activité physiologique, a un grand potentiel en tant que molécule thérapeutique. Cependant, un inconvénient majeur de l’instabilité métabolique, à savoir la demi-vie de 3 min en circulation et le manque de sélectivité envers les différents sous-types de récepteurs (sst1 − 5), a conduit au développement de centaines d’analogues synthétiques. de SST.8 Un de ces analogues, seglitide (MK678) (figure ​ (figure1), 1), qui a été trouvé sélectif vers le sous-type de récepteur SST 2 (sst2) et a montré un contrôle amélioré de l’hyperglycémie postprandiale chez le diabétique Les animaux administrés en association avec de l’insuline ont attiré notre attention.9 Figure 1 TS (SRIF-14 et -28) et seglitide (MK678). Le pharmacophore de SST et de seglitide (MK678) est surligné en rouge. Il a été montré que la N-méthylation multiple augmente la sélectivité et la stabilité métabolique des récepteurs et améliore la biodisponibilité orale des peptides.10,11 Le potentiel de la N-méthylation sur le squelette peptidique est long Nous avons déjà montré que la N-méthylation multiple du squelette peptidique dans les peptides cycliques induit des propriétés physicochimiques remarquables, comme par exemple l’introduction de la liaison cis-peptide12 et du cisaillement du peptide. c’est-à-dire, une stabilité métabolique accrue et une absorption accrue à travers la paroi intestinale avec une augmentation globale de la biodisponibilité orale.11 Ainsi, nous avons synthétisé une bibliothèque focalisée de seglitide multiple N-méthylé, où seules les liaisons amides orientées extérieurement (ou -méthylé. Cette bibliothèque biaisée a été synthétisée sur la base de notre expérience précédente avec des hexapeptides RGD cycliques14 et des analogues de SST, où la N-méthylation des liaisons amides exposées au solvant (qui n’intervient dans aucune interaction avec le récepteur) a conservé la conformation bioactive, montrant une activité biologique significative. La bibliothèque focalisée de séglitide N-méthylé est composée de N-méthylations supplémentaires à d-Trp8, Lys9 et Phe11 (la numérotation est basée sur la séquence originale de SRIF-14) (Tableau 1). Ces résidus ont été sélectionnés, car la N-méthylation de ces liaisons amides devrait conserver la conformation du peptide cyclique. La N-méthylation des acides aminés Fmoc-l-Ala et Fmoc-l-Phe a été réalisée en solution par la méthode de Freidinger.15 Pour obtenir des dérivés N-méthylés contenant N-Me-Lys (Boc) et N-Me-Trp (Boc), une méthode de Mitsunobu améliorée a été employée.16 Les peptides linéaires ont été synthétisés sur un support solide en utilisant SPPS standard (synthèse peptidique en phase solide) en utilisant HOBt (1-hydroxybenzotriazole) et TBTU [2- (1H-benzotriazole-1-yl) Tétrafluoroborate de 1,1,3,3-tétraméthyluronium] comme réactifs de couplage et DIEA (N, N-diisopropyléthylamine) comme base sur une résine de chlorotritylchlorure de polystyrène (résine TCP). Pour le couplage des acides aminés sur les peptides N-méthylés, HOAt (1-hydroxy-7-aza-benzotriazole) et HATU [2- (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3, 3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate] ont été utilisés avec de la collidine comme base. La cyclisation des peptides linéaires a été réalisée avec HATU et HOBt avec de la collidine comme base dans des conditions de dilution élevées en solution pour éviter toute cyclodimérisation et oligomérisation.10 Tableau 1 Analogues SST synthétisés N-méthylésLes activités des analogues de SST décrits ci-dessus ont été étudiées au moyen de un essai pharmacologique in vitro sur la libération du neuropeptide sensoriel CGRP à partir des terminaisons périphériques des nerfs sensitifs de la trachée isolée du rat.La technique expérimentale utilisée fournit une détection sensible des effets des médicaments au niveau des terminaisons nerveuses périphériques.4,5 Les paramètres de stimulation du champ électrique (EFS) pour induire la libération de CGRP ont été choisis pour être sélectifs pour les nerfs. Les rats ont été exsanguinés en anesthésie profonde, et la trachée entière a été enlevée et nettoyée des tissus conjonctifs adhérents. Des trachées de deux rats ont été placées dans le même bain d’organe (1,8 ml) pour obtenir une quantité suffisante de peptide libéré et perfusé (1 ml / min) avec une solution de Krebs oxygénée contrôlée au pH (7,2) pendant 60 minutes (période d’équilibre) à 37 ° C. ° C. Après l’arrêt du flux, la solution a été changée trois fois pendant 8 minutes pour produire des fractions post-stimulées, stimulées, post-stimulées. Au cours de la deuxième période de 8 minutes, EFS (40 V, 0,1 ms, 10 Hz pendant 120 s, 1200 impulsions) a été réalisée pour déclencher la libération de neurotransmetteurs. La concentration de CGRP a été déterminée à partir de 200 échantillons du milieu d’incubation par une technique de dosage radioimmunologique sélectif et spécifique (RIA) comme décrit précédemment en détail.17 La sortie du peptide a été exprimée comme la quantité libérée par poids de tissu humide. La limite de détection de l’essai était de 0,2 fmol / tube. Les peptides ont été ajoutés dans le milieu d’incubation au début de la seconde et de la troisième fraction de 8 min à une concentration de 500 nM. Chaque composé a été testé dans des expériences séparées; un seul peptide a été appliqué sur les mêmes trachées. Dans chaque groupe, cinq expériences ont été réalisées pour fournir n = 5 points de données par groupe (10 trachées par groupe). Les résultats ont été évalués par le test non paramétrique Mann − Whitney U (comparaisons non appariées) et p < Dans les expériences de contrôle, EFS (1200 impulsions) a évoqué une augmentation d'environ 5 et 3,5 fois de la sortie de CGRP dans les fractions stimulées et poststimulées, respectivement, par rapport à la libération basale. Celui-ci était significativement inhibé en présence de 500 nM3 (di-N-méthylé), 4 (tri-N-méthylé) et 7 (tétra-N-méthylé) (figure 22A). A) Représentation graphique de l'effet des analogues de la SST sur la libération de CGRP induite par EFS (40 V, 0,1 ms, 10 Hz pendant 120 s, 1200 impulsions) à partir des fibres sensorielles des trachées isolées de rats. concentration mesurée ... Le composé 7 induit la plus grande action inhibitrice à environ 70% dans la période stimulée et abolit complètement le débit sortant du CGRP dans la fraction post-stimulée Les actions inhibitrices ont été observées pour ces trois analogues (3, 4 et 7) libération totale de CGRP induite par l'EFS (Tableau 2). Tableau 2 Effet du peptide analogue MK678 de SST et de ses dérivés sur la libération totale de CGRP évoquée par l'EFS (libération en pourcentage dans les fractions stimulées et poststimulées ensemble par rapport à la décharge spontanée basale, non stimulée et spontanée ) aParce que le CGRP est un médiateur important des neurogènes l'inflammation, l'efficacité des composés à diminuer sa libération électriquement évoquée in vitro peut être considérée comme un indicateur d'efficacité pour inhiber les réactions inflammatoires neurogéniques in vivo. Du fait que les analogues 3, 4 et 7 ont exercé des actions inhibitrices significatives sur la libération de CGRP in vitro, ils ont été examinés sur 1% d'extravasation de protéine plasmatique neurogène induite par l'huile de moutarde dans la peau de patte de rat. Il a été démontré que cette concentration d'huile de moutarde stimule sélectivement les nerfs sensibles à la capsaïcine et induit une réaction inflammatoire aiguë purement neurogène. Chaque composé (100 μ g / kg) a été administré ip 10 min avant l'induction de l'inflammation. A titre de comparaison, le solvant a été administré à la place des analogues https://l-e-v-i-t-r-a.com. Cette étude a été entreprise en blocs avec 14 rats par occasion. L’ensemble des données a été obtenu pendant 6 jours. Il y avait deux ou trois rats traités au solvant tous les jours, et les 12 animaux restants ont été randomisés pour recevoir chaque traitement.Injection intrapéritonéale de 100 μ g / kg 7 induite la plus grande, environ 40% d’action inhibitrice sur 1% d’huile de moutarde l’extravasation des protéines plasmatiques neurogènes aiguës provoquée dans la peau de la patte de rat (figure ​ (figure 2B) .2B). Cependant, 3 et 4 n’inhibent pas significativement cette réponse inflammatoire neurogène. La comparaison de l’affinité de liaison au récepteur (Tableau 3) de la N-méthylée synthétisée et de la SST native vers sst1 & spplus 5 révèle des faits intéressants. La SST native ne montre aucune sélectivité pour les récepteurs, tandis que le séglitide (MK678) présente une affinité et une sélectivité élevées vis-à-vis de sst2. Parmi les différents analogues N-méthylés, les analogues di-N-méthylés 1, 2 et 3 présentent un profil similaire d’affinité et de sélectivité vis-à-vis de sst2. Cependant, ceci ne peut être observé que dans le cas de deux analogues tri-N-méthylés 4 et 5, alors que dans le cas de 6, il y a une perte soudaine d’affinité envers sst2. Ceci peut être expliqué sur la base du profil de N-méthylation dans les analogues di-N-méthylés.Dans le cas de ces analogues hexapeptidiques cycliques de la SST, la N-méthylation à Lys9 maintient ou augmente l’affinité de l’analogue résultant en renforçant la conformation bioactive du peptide cyclique par deux tours supplémentaires.11 Cependant, dans le cas de 4 et 5, les N-méthylations à d-Trp8 et Phe11, respectivement, entraînent une perte subtile de la conformation bioactive en perturbant les phases stabilisantes, mais cette perte est compensée par la N-méthylation à Lys9, montrant une meilleur profil d’affinité et de sélectivité. Au contraire, ce n’est pas le cas pour 6, où les deux γ -turns sont déstabilisés par des N-méthylations à d-Trp8 et Phe11, ce qui entraîne une affinité plus faible, qui ne peut être compensée par des N- méthylation à Lys9 tel qu’observé dans l’analogue tétra-N-méthylé. 7.Tableau 3IC50 Valeurs (nM) de MK678 et les analogues N-méthylés synthétisés vers les différents sous-types de récepteurs SST utilisant l’autororadiographie des récepteurs in vitro18As 7 est très puissant dans l’inhibition Libération de CGRP, in vitro et in vivo (malgré la valeur IC50 la plus faible vers sst2), la conformation de la solution a été déterminée en employant des études de RMN 2D étendues et des simulations MD (dynamique moléculaire) étendues. La conformation de 7 est représentée sur la figure ​ Un ROE très fort entre N-Me-Phe11 H α et N-Me-Ala6 H α montre clairement que la liaison peptidique entre NMe-Phe11 et NMe-Ala6 est en cis-conformation. Aucun autre ROE n’a été observé entre d’autres α -protons de résidus voisins, ce qui indique que toutes les autres liaisons peptidiques sont en conformation trans. Bien que la plupart des liaisons amides soient N-méthylées, deux cycles de N-Me-d-Trp8, N-Me-Lys9 et N-Me-Phe11, N-Me-Ala6 présentent une liaison hydrogène intramoléculaire caractéristique. modèle par l’intermédiaire des deux atomes HN. Figure 3 (A) Formule structurelle de 7. (B) Stéréoview de la structure de la solution de 7 tel que déterminé par spectroscopie RMN et calculs MD. La conformation montrée ici a été extraite par l’analyse de groupe comme la trame la plus représentative du calcul de MD. Selon les angles dièdres dorsaux de NMe-d-Trp8 (Φ = 92 &#x000b0 ;, Ψ = &#x02212 ; 99 °) et N-Me-Lys9 (Φ = − 119 &#x000b0 ;, Ψ = 5 °), la structure obtenue à partir de la simulation MD restreinte possède un &#x003b2 ; -turn (type II ′) centré sur ces deux résidus.19 Une distance de 2,2 Å entre le proton amide Val10 et l’oxygène carbonyle Tyr7, un angle de liaison hydrogène de 129 &#x000b0 ;, et un gradient de température faiblement négatif de Val10 HN (− 0,3 ppb / K dans DMSO) indiquent que la liaison hydrogène dans ce tour est plutôt fort. Une seconde β -turn (type VIa) possède des angles dièdres de N-Me-Phe11 (Φ = − 44 &#x000b0 ;, Ψ = 122 °) et N-Me -Ala6 (Φ = − 119 &#x000b0 ;, Ψ = 77 °) et une configuration cis de la liaison peptidique entre N-Me-Phe11 et N-Me-Ala6. Une distance de 1,8 Å entre le proton amide Tyr7 et l’oxygène carbonyle Val10, un angle de liaison hydrogène de 151 &#x000b0 ;, et un gradient de température faiblement négatif de Tyr7 HN (− 1,3 ppb / K dans DMSO) indiquent que la liaison hydrogène dans ce β -turn est encore plus fort que la liaison hydrogène du type II ′ β -turn.Le Tyr7 HN-Val10 O ′ et Val10 HN-Tyr7 O ′ les liaisons hydrogène orientent les résidus Tyr7 et Val10 dans une géométrie que l’on trouve habituellement pour les résidus liés individuellement à l’hydrogène dans les chaînes antiparallèles voisines. Les angles dièdres de la colonne vertébrale de Tyr7 (Φ = − 116 &#x000b0 ;, Ψ = 110 °) et Val10 (Φ = − 163 &#x000b0 ;, Ψ = 102 °) confirmer la similitude avec cet élément de structure secondaire, car ils sont proches des angles dièdres épine dorsale correspondants en parallèle et antiparallèles β -sheets.Besides liaison hydrogène, cluster hydrophobe de la Val10 &#x003b3 les groupes -méthyle avec le groupe N-Me-Lys9N-méthyle et du groupe N-Me-Ala6 -méthyle dans la région π -sufrace du noyau N-Me-Phe11 phényle voisin semblent se stabiliser la conformation du squelette peptidique (figure 33). Les exigences spatiales élevées des quatre groupes N-méthyle et des deux fortes liaisons hydrogène entre les résidus Tyr7 et Val10 indiquent que l’épine dorsale de 7 doit être dans un conformation définie et plutôt rigide, telle qu’observée lors de la simulation MD étendue, ce qui suggère que sa conformation de squelette en solution est pratiquement identi cal à la conformation dans l’état lié au récepteur (description détaillée dans les Informations de Support). Même de faibles changements conformationnels du squelette pendant le processus de liaison pourraient être fortement défavorisés thermodynamiquement et expliquer l’affinité comparativement faible à sst2, par rapport à d’autres analogues moins contraints qui pourraient s’adapter à la poche de liaison sst2 plus facilement.En conclusion, nous montrons ici qu’une N-méthylation multiple conçue d’un analogue de SST pourrait moduler la propriété pharmacologique des analogues N-méthylés d’une manière sans précédent. On a déjà signalé que l’inflammation neurogène était inhibée par la liaison de la SST et de ses analogues aux récepteurs SST sst1 et sst4.20. Cependant, les analogues N-méthylés, que nous décrivons ici, montrent une diminution significative de la libération de CGRP in vitro et de l’inflammation neurogène aiguë. in vivo et ne révèlent aucune liaison significative à sst1 / 4 mais préférentiellement à sst2. Par conséquent, il est encourageant de noter que la N-méthylation multiple peut non seulement s’avérer être une approche pour moduler la propriété pharmacocinétique des peptides, mais pourrait également ajouter une dimension supplémentaire aux peptides en montrant de nouvelles propriétés pharmacologiques. Nous étudions actuellement le comportement conformationnel détaillé de tous les analogues N-méthylés afin de mieux comprendre la relation structure −